本发明专利技术涉及糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用，属于分子生物学技术领域。一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对EST-SSR分子标记特异引物。本发明专利技术还提供EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。本发明专利技术用于建立糙皮侧耳的核心种质库，使用方便，能简单快捷的进行种质资源的遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究；相较传统方法，可以大大缩短分析周期，提高研究效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异弓I物体系及其应用，属于分子生物学
技术介绍
糙皮侧耳是我国第一大食用菌栽培菌种。在人们长期的生产实践中，积累了丰富而珍贵的糙皮侧耳种质资源，特别是近年来，随着糙皮侧耳栽培产业的迅速发展，糙皮侧耳的种质资源也在不断扩大。据不完全统计，目前我国糙皮侧耳栽培品种(包括国外引进菌种)已达300多个。丰富的种质资源为糙皮侧耳品种改良、新品种选育以及遗传工程奠定了基础。然而，糙皮侧耳种质资源库不断扩大，对育种工作者来说，要想知道这些育种材料的详细信息，并进行深入细致的评价鉴定，变得越来越困难。特别是由于我国食药用菌品种登记制度尚未完善，糙皮侧耳的生产用菌种比较混乱，同种异名和同名异种现象在栽培生产上非常普遍，这就给育种工作者正确评价和鉴定这些种质资源带来很大的不便。因此，如何更有效地保存和开发利用现有糙皮侧耳种质资源，特别是对特异种质材料进行有效地筛选和挖掘，是当前迫切需要解决的问题。目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法，尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发 EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言， 由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。然而，由于食药用真菌基因组学研究的相对滞后，EST-SSR标记技术在食药用真菌中的研究很少，仅见在香菇和真姬菇中有研究报道，而在糙皮侧耳中尚未开展该方面的研
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物GLlF :ctgctcgttgtacacgcttc(SEQ ID NO. 1), GLlR :gaaagacagacgcgggatta ； (SEQ ID NO. 2)；GL2F :ggtaatctcggcttcacgat(SEQ ID NO. 3), GL2R :ttgagaatcttcggcacctc(SEQ ID NO. 4)；GL4F :gagcaggcgatctctttcaa(SEQ ID NO. 5), GL4R :gcgaagggagtggtacacat(SEQID NO. 6)；GL19F :agtacgtagctgccgtccag(SEQ ID NO. 7) , GL 1 9R cctgatacgtcccgtaacca(SEQ ID NO. 8)。上述体系，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物GL26F :tatgggcatgatgaagaacg(SEQ ID NO. 9) , GL26R cgacgacgacgactatgaga(SEQ ID NO· 10)。上述体系，还包括核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物GL38F :tctttacatccacgccatga(SEQ ID NO. 1 1) , GL38R caaagtgaaggtgagcgaca(SEQ ID NO. 12)0上述EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。上述应用，步骤如下(1)提取样品 DNA;(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用EST-SSR分子标记特异引物体系中的成对引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得PCR产物；(3)将步骤( 制得的得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对结果进行遗传多样性分析和多态性统计分析。所述步骤(1)提取样品DNA，步骤如下(i)刮取菌丝用液氮研磨，加入CTAB及RNA酶于60_65°C水浴l_2h ；(ii)4°C 12000rpm离心lOmin，取上清加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比24 1)，混勻后，4°C 12000rpm离心IOmin ；(iii)重复步骤(ii)；(iv)取上清加入2倍体积的无水乙醇于_20°C静置2h ；(v) 40C 8000rpm离心lOmin，弃上清，用70 %乙醇洗2-3次，倒置晾干，加入适量TE溶解，即得样品DNA。所述步骤⑵的PCR扩增，反应体系为糙皮侧耳基因组DNA 50-100ng，10X 缓冲液 2. 5μ L，2. 5mmol 的 dNTPs 2 μ L, 2. 5U· μ L1Taq-O. 25 μ L，浓度为10 μ M · L—1的正向引物溶液1 μ L，浓度为10 μ M · L—1的反向引物溶液1 μ L，添加(MH2O至体系体积为25 μ L ；PCR反应程序为94°C预变性5min后进入循环；94°C变性30s ；53 56°C复性 45s ；72°C延伸Imin,反应35个循环；72°C延伸IOmin0所述步骤(3)的琼脂糖凝胶电泳为2%的琼脂糖凝胶电泳。所述步骤(3)的遗传多样性分析是根据EST-SSR分子标记特异引物体系中的特异引物在糙皮侧耳样品DNA的扩增结果，经过统计清晰稳定的条带后，应用非加权类平均聚类方法对糙皮侧耳样品进行聚类分析。可参考(Sokal R R,Michener C D. A statistical method for evaluating systematic relationships. Univ Kansas Sci Bull,1958, 28 :1409-1438) (Sneath P H, Sokal R R. Numerical Taxonomy :The Principal and Practice of Numerical Classification. San Francisco :ff. H. Freeman and Company, 1973)中的记载。所述步骤(3)的多态性统计分析是根据统计在同一电泳迁移位置扩增条带的有无，有扩增条带的记为1，没有扩增条带的记为0，生成分子数据矩阵；然后，利用NTSYS2. 1 软件的非加权平均数法(UPMGA)进行了聚类分析。可参考(Sokal R R, Michener C D. A statistical method for evaluating systematic relationships. Univ Kansas Sci Bull，1958,28 :1409-1438)或(Sneath P H, Sokal R R. Numerical Taxonomy :The Principal and Practice of Numerical Classification. San Francisco :ff.H.Freeman and Company, 1973)中的记载。有益效果1、本专利技术初步构建了糙皮侧耳的EST-SSR分子标记特异引物体系，该体系本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种糙皮侧耳ＥＳＴ－ＳＳＲ分子标记特异引物体系，它包括４对核苷酸序列如下所示的ＥＳＴ－ＳＳＲ分子标记特异引物：ＧＬ１Ｆ：ｃｔｇｃｔｃｇｔｔｇｔａｃａｃｇｃｔｔｃ，ＧＬ１Ｒ：ｇａａａｇａｃａｇａｃｇｃｇｇｇａｔｔａ；ＧＬ２Ｆ：ｇｇｔａａｔｃｔｃｇｇｃｔｔｃａｃｇａｔ，ＧＬ２Ｒ：ｔｔｇａｇａａｔｃｔｔｃｇｇｃａｃｃｔｃ；ＧＬ４Ｆ：ｇａｇｃａｇｇｃｇａｔｃｔｃｔｔｔｃａａ，ＧＬ４Ｒ：ｇｃｇａａｇｇｇａｇｔｇｇｔａｃａｃａｔ；ＧＬ１９Ｆ：ａｇｔａｃｇｔａｇｃｔｇｃｃｇｔｃｃａｇ，ＧＬ１９Ｒ：ｃｃｔｇａｔａｃｇｔｃｃｃｇｔａａｃｃａ。
【技术特征摘要】
1.一种糙皮侧耳EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括4对核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子标记特异引物GLlF :ctgctcgttgtacacgcttc，GLlR gaaagacagacgcgggatta ；GL2F :ggtaatctcggcttcacgat，GL2R :ttgagaatcttcggcacctc ；GL4F :gagcaggcgatctctttcaa，GL4R gcgaagggagtggtacacat ；GL19F :agtacgtagctgccgtccag，GL19R :cctgatacgtcccgtaacca02.如权利要求1所述的特异引物体系，其特征在于，还包括核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子标记特异引物GL26F :tatgggcatgatgaagaacg，GL26R :cgacgacgacgactatgaga03.如权利要求1所述的特异引物体系，其特征在于，还包括核苷酸序列如下所示的 EST-SSR分子标记特异引物GL38F :tctttacatccacgccatga，GL38R :caaagtgaaggtgagcgaca04.权利要求1所述EST-SSR分子标记特异引物体系在糙皮侧耳遗传多样性分析和种质资源鉴定方面的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下(1)提取样品DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用EST-SSR分子标记特异引物体系中的成对引物分别PCR扩增EST-SSR分子标记，得PCR产物；(3)将步骤( 制得的得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对结果进行遗传多样性分析和多态性统计分析。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)提取样品DNA，步骤如下(i)刮取菌丝用液氮研磨，加入CTAB...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚强，宫志远，高兴喜，张雪梅，韩建东，任鹏飞，万鲁长，任海霞，赵军胜，李瑾，曲玲，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：88
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