南海红树林内生真菌BL321制造技术

本发明专利技术公开了一种南海红树林内生真菌，属于生物高技术领域。所用菌株为BL321，经鉴定为鹿角菌属（Xylariasp.），菌种保藏号为CCTCCM2010357，该菌株的16SrDNA的Genbank登录号为HM569607。主要生物学特性为该菌菌落表面为乳白色细丝羽绒状，背面为麦黄色，匍匐扩散型生长，无孢子生成，为好氧型真菌，其所产部分新型化合物具有明显的抗肿瘤活性。本发明专利技术生产方便，成本低，节能环保，是开发新型天然药物的一种理想载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利涉及一株产抗肿瘤活性化合物的南海红树林内生真菌，属于生物

技术介绍
红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落，红树林真菌是共生于其中的一个特殊群体，由于其独特的生存环境，能够产生出许多结构新颖的代谢产物，成为目前研究最多和最系统的海洋真菌，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200种，随着对其研究的深入，红树林内生真菌作为一种海洋微生物资源，许多结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物不断被报道，已成为海洋药物开发的一种重要资源[林永成，周世宁，《海洋微生物及其代谢产物》，北京化工出版社，2003。刘爱荣，吴晓鹏，徐同，红树林内生真菌研究 进展，废原生态学报，2007,18(4) :912-918。]对于红树林真菌办sp.，我们先后从办hria sp. 2508菌株中发现了具有钙离子通道抑制作用的Xyloketal A、B、F，其中Xyloketal F的最大最强抑制浓度达至Ij 0.03 μ M，[X. -Y. ffu, X. -H. Liu, Y. -C, Lin, J. -H. Luo, Ζ. -G. She, H. -J. Li, L. -ff. Chan, S. Antus, T. Kurtan, B. Elsasser, K. ￥,ro\m,Eur. J. Org. Chem. 2005, 4061-4064.]和具有对 DNA 亲和性的 xylopyridine A[Xu Fang. Pang Jiyang, et al. Chinese Journal of Chemistry, 2009，27, 365-368]等活性天然化合物。Xylaria sp. BL321是一株产抗肿瘤天然产物的内生真菌，对其深入研究，有助对该方面先导化合物的认识与开发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可产生抗肿瘤化合物的南海红树林内生真菌BL321。本专利技术的另一目的在于保护南海红树林内生真菌BL321在制备抗肿瘤药物方面的应用。专利技术通过以下技术方案实现上述目的本专利技术提供了南海红树林内生菌BL321，采自广东阳江红树林海岸带白榄树叶，经鉴定为鹿角菌属a>7ariasp.)，于2010年12月20日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 菌种保藏号为CCTCC M 2010357，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM569607 ；该菌生物学特性为菌落表面为乳白色细丝羽绒状，背面为麦黄色，匍匐扩散型生长，无孢子生成，为好氧型真菌；其所产部分新型化合物具有明显的抗肿瘤活性。该内生真菌BL321的基因序列如SEQ ID NO 1所示1 tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtctc cgttggtgaa ccagcggagg gatcattaaa 61 gagttatcat aactcctaaa acccatgtga accttacctt tgttgcctcg gcaggtctgc 121 agcttaccct gtaagcacct accctgtagg tactttaccc ggtagttgta ggaaagaaac 181 ctgccggtgg tatattaaaa aaacctcttt gtttgttatg ttattctgaa ttctataatt241 aataaagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 301 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 361 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 421 cctcgttgct tagcgttggg agcttacaaa acaacccttt gtagttcctt aaagttagtg 481 gcggagttgg tttcacactc tagacgtagt aagatttatt atctcgccta tagatgagcc 541 ggtctcctgc cgtaaaaacc cccttacttc ttaaaggttg acctcggatc aggtaggaat 601 acccgctgaa cttaagcata tcaatagccg ggaggaaa 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果(1)南海红树林内生真菌BL321产独特结构的化合物，经测试，部分化合物具有高效的肿瘤细胞抑制作用。(2)本专利技术生产成本低，节能环保，是开发新型天然药物的理想载体。 (3)本专利技术生产周期短，分离制备较容易，易于扩大生产。具体实施例实施例1.菌种的分离与保藏。将采来的白榄树叶表面彻底消毒后，在超净台内将其剪碎，放入预先准备好的无菌水中浸泡十分钟，用浸提液涂布于PDA平板上，28°C静置培养5-7天，等菌长出后，挑取单个菌落二次涂布平板，直到所长菌落为单一菌落为止。于PDA斜面内4°C保藏。BL321的菌落形态为无包子生成的乳白色细丝羽绒状，背面为麦黄色，匍匐扩散型生长。实施例2. 菌种BL321的鉴定。将BL321从PDA斜面培养基转入PDA平皿培养基培养，培养5_7天，形成白色匍匐菌丝，刮去菌丝体，用真菌DNA提取试剂盒提取DNA。提取的DNA用ITS4RATSiF 50 μ L反应体系，扩增 ITS-rRNA。反应条件为 94°C 3min，35 次循环-MV 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 72°C8min。DNA鉴定用DNA双向测序，测序结果经基因文库检索比对为Max index为91%， 确定为鹿角菌。实施例3.活性成分的提取与分离。B321从斜面活化后，将带有菌丝体的琼脂快接种于含250mL GYT培养基的500mL 三角瓶中，在28°C下，摇床rpm 120，培养5_7天，在对数生长期转接扩大培养，每个含500mL GYT培养基的IL三角瓶接种lmL，在28°C下，摇床rpm 120，培养5_7天(或静置30天)，收取菌体。菌体经干燥粉碎后，用3倍体积乙酸乙酯(EA)萃取5次，萃取液浓缩后用EA/石油醚(PE)以10%的梯度进行柱色谱层析，得到极性EA/PE在40%左右的组分，组分经浓缩、 重结晶后得含量在80%左右的已知艾里莫芬烷类的倍半萜化合物S6-2 (07H239-A)，其每升发酵液的产量达到20mg左右，对其进行进一步色谱柱层析和HPLC，在极性为甲醇水 乙酸=75:25:0. 1、流速为1. 5mL/min、254nm波长检测的条件下，又得到同系列的4个微量新化合物。初步检测部分化合物具有明显的抗肿瘤活性和α-葡萄糖甘酶的激活活性。 07Η239-Α曾有报道其对24株肿瘤细胞的平均IC5tl为3. 2 μ g/mL [L. A. McDonald, L. R. Barbieri, V. S. Bernan, J. Janso, P. Lassota, G. T. Garter, J. Nat. Prod. 2004, 67, 1565.]。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．南海红树林内生菌ＢＬ３２１，为分自广东阳江红树林海岸带白榄树叶的内生真菌，经鉴定为鹿角菌属（Ｘｙｌａｒｉａｓｐ．），于２０１０年１２月２０日寄存于中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ），菌种保藏号为ＣＣＴＣＣ　Ｍ　２０１０３５７，该菌株的１６Ｓ　ｒＤＮＡ　的Ｇｅｎｂａｎｋ　登录号为ＨＭ５６９６０７；该菌生物学特性为菌落表面为乳白色细丝羽绒状，背面为麦黄色，匍匐扩散型生长，无孢子生成，为好氧型真菌。

【技术特征摘要】
1.南海红树林内生菌BL321，为分自广东阳江红树林海岸带白榄树叶的内生真菌， 经鉴定为鹿角菌属(Jylariasv.)，于2010年12月20日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为CCTCC M 2010357，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为 HM...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，宋永相，刘岚，林永成，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81