一种利用蓝藻将CO2生物转化为异丙醇的技术制造技术

本发明专利技术公开了一种利用蓝藻将CO2生物转化为异丙醇的技术。本发明专利技术提供了如下6种方法制备的重组蓝藻：(1)将辅酶A转移酶基因、乙酰乙酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因导入蓝藻(2)将辅酶A转移酶基因和乙酰乙酸脱羧酶基因导入蓝藻；(3)将醇脱氢酶的编码基因导入(2)所述重组蓝藻；(4)将乙酰辅酶A乙酰转移酶基因、乙酰乙酰辅酶A转移酶基因、乙酰乙酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因导入蓝藻；(5)将乙酰辅酶A乙酰转移酶基因、乙酰乙酰辅酶A转移酶基因和乙酰乙酸脱羧酶基因导入蓝藻；(6)将醇脱氢酶基因导入(5)所述产丙酮的重组蓝藻。利用本发明专利技术重组蓝藻来生产丙酮和异丙醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物新能源领域和环境保护领域，涉及一种利用蓝藻将(X)2生物转化为异丙醇的技术，具体涉及可以生产异丙醇的重组蓝藻。
技术介绍
全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源的要求，而粮食短缺要求可再生清洁能源的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。蓝藻(blue-green algae)，又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用二氧化碳和太阳能快速繁殖，是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，易于基因操作。近二十年来蓝藻分子生物学的研究进展为对蓝藻进行基因改造进而合成化工产品奠定了基础，已有在蓝藻中合成乙醇的成功案例(专利US6699696)。 太阳能是地球上取之不尽的能源，而二氧化碳是导致地球变暖的温室气体，全球每年投入数以亿计资金用于二氧化碳减排。因此，通过对蓝藻进行代谢途径改造，使蓝藻将太阳能和二氧化碳直接转化为能源化工产品，是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之ο异丙醇(isopropanol)是重要的化工产品和原料。主要用于制药、化妆品、塑料、 香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。异丙醇作为低成本溶剂或萃取剂在工业和消费产品中的生产中广泛应用。低品质的异丙醇还可用在汽车燃料中。在许多情况下异丙醇可代替乙醇使用。2010年我国对异丙醇的年需求总量将达到30万吨，我国异丙醇主要用作油墨、涂料和制药工业过程中的溶剂或萃取剂，其消费量约占异丙醇总消费量的60%。 在化学中间体领域，我国异丙醇主要用于生产异丙胺、异丙醚以及一些酯类，其消费量约占异丙醇总消费量的25%。异丙醇在其他方面的应用主要包括电子工业清洗剂、汽车防冻液、 消毒剂、洗涤用品、日化产品等，其消费量约占异丙醇总消费量的15%。异丙醇是石油化工发展史上从石油原料制得的第一个化工产品。目前工业上用的异丙醇仍是来自石油化工产品。从70年代起，由于石油危机，使各种醇类发酵生产成为研究热点，如生物乙醇，生物丁醇及生物异丙醇。通过三十几年的研究，解析了上述醇类的合成途径及相关酶，为改造微生物生产生物异丙醇奠定了基础。近年来，美国和日本的科学家先后在大肠杆菌建立异丙醇合成途径，并得到可以利用葡萄糖产异丙醇的菌株。这种方法虽然避免了加剧化石能源短缺的问题，但大肠杆菌为异养菌，仍需利用葡萄糖生产异丙醇， 没有解决发展生物能源与粮食问题的冲突，无法实现可再生能源的持续发展，因此可以直接利用太阳能的光合自养细菌蓝藻是实现异丙醇生物合成的理想宿主。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用蓝藻将(X)2生物转化为异丙醇的技术。本专利技术提供的重组蓝藻，为如下(1)至(6)中的任意一种(1)将乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻I ； (2)将乙酰乙酰辅酶 A转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产丙酮的重组蓝藻II ； (3)将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻II的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻III ； (4)将乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶A 转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组 DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻IV ； (5)将乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产丙酮的重组蓝藻V ； (6)将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻V的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻VI。所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酰辅酶A转移酶可为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乙酰辅酶A转移酶功能的由(a)衍生的蛋白质。所述(1)或⑵或(4)或(5)中，所述乙酰乙酸脱羧酶可为如下(c)或(d)(c)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乙酸脱羧酶功能的由(c)衍生的蛋白质。所述⑴或(3)或(4)或(6)中，所述醇脱氢酶可为如下(e)或(f)(e)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有醇脱氢酶功能的由(e)衍生的蛋白质。所述⑷或(5)中，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶可为如下(g)或(h)(g)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(g)衍生的蛋白质。所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因可为如下(I)、(II)或(III)(I)序列表中序列1自5，末端第427至1746位核苷酸所示的DNA分子；(II)在严格条件下与⑴限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(III)与(I)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因可为如下(IV)、(V)或(VI)(IV)序列表中序列1自5，末端第1747至M81位核苷酸所示的DNA分子；(V)在严格条件下与(IV)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(VI)与(IV)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述醇脱氢酶的编码基因可为如下(VII)、(VIII)或(IX)(VII)序列表中序列1自5，末端第M82至3537位核苷酸所示的DNA分子；(VIII)在严格条件下与(VII)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(IX)与(VII)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因可为如下(X)、(XI)或(XII)(X)序列表中序列9自5，末端第401至1579位核苷酸所示的DNA分子；(XI)在严格条件下与⑴限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(XII)与⑴限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述产异丙醇的重组蓝藻I是将双链DNA甲通过同源重组导入蓝藻的基因组DNA 得到的；所述双链DNA甲包括所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和所述醇脱氢酶的编码基因。所述双链DNA甲的两端分别具有所述蓝藻的基因组DNA的同源臂。所述双链DNA甲的两端优选具有聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因 (slrl829)的同源臂。所述双链DNA甲上还具有筛选基因。所述筛选基因优选为氯霉素抗性基因。得到所述产异丙醇的重组蓝藻I的过程中，所述同源重组是通过将重组质粒甲导入所述蓝藻实现的；所述重组质粒甲上携带所述双链DNA甲。所述重组质粒甲为以载体 PUC-18为骨架载体，在骨架载体的多克隆位点分别插入序列表的序列2自5’末端第9至 1653位核苷酸所示DNA和序本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．重组蓝藻，为如下（１）至（６）中的任意一种：（１）将乙酰乙酰辅酶Ａ转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组ＤＮＡ得到的产异丙醇的重组蓝藻Ｉ；（２）将乙酰乙酰辅酶Ａ转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组ＤＮＡ得到的产丙酮的重组蓝藻ＩＩ；（３）将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻ＩＩ的基因组ＤＮＡ得到的产异丙醇的重组蓝藻ＩＩＩ；（４）将乙酰辅酶Ａ乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶Ａ转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组ＤＮＡ得到的产异丙醇的重组蓝藻ＩＶ；（５）将乙酰辅酶Ａ乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶Ａ转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组ＤＮＡ得到的产丙酮的重组蓝藻Ｖ；（６）将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻Ｖ的基因组ＤＮＡ得到的产异丙醇的重组蓝藻ＶＩ。

【技术特征摘要】
1.重组蓝藻，为如下(1)至(6)中的任意一种(1)将乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻I ；(2)将乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产丙酮的重组蓝藻II ；(3)将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻II的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻III ；(4)将乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻IV ；(5)将乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因和乙酰乙酸脱羧酶的编码基因导入蓝藻的基因组DNA得到的产丙酮的重组蓝藻V ；(6)将醇脱氢酶的编码基因导入所述产丙酮的重组蓝藻V的基因组DNA得到的产异丙醇的重组蓝藻VI。2.如权利要求1所述的重组蓝藻，其特征在于所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酰辅酶A转移酶为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰乙酰辅酶A转移酶功能的由(a)衍生的蛋白质；所述⑴或⑵或⑷或(5)中，所述乙酰乙酸脱羧酶为如下(c)或⑷(c)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰乙酸脱羧酶功能的由(c)衍生的蛋白质；所述⑴或⑶或⑷或(6)中，所述醇脱氢酶为如下(e)或(f)(e)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有醇脱氢酶功能的由(e)衍生的蛋白质；所述⑷或(5)中，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶为如下(g)或(h)(g)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(g)衍生的蛋白质。3.如权利要求2所述的重组蓝藻，其特征在于所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因为如下(I)、(II)或(III)(I)序列表中序列1自5，末端第427至1746位核苷酸所示的DNA分子；(II)在严格条件下与(I)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(III)与(I)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因为如下(IV)、(V)或(VI)(IV)序列表中序列1自5，末端第1747至M81位核苷酸所示的DNA分子；(V)在严格条件下与(IV)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(VI)与(IV)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述醇脱氢酶的编码基因为如下(VII)、(VIII)或(IX)(VII)序列表中序列1自5，末端第M82至3537位核苷酸所示的DNA分子；(VIII)在严格条件下与(VII)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(IX)与(VII)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(X)、(XI)或(XII)(X)序列表中序列9自5’末端第401至1579位核苷酸所示的DNA分子；(XI)在严格条件下与(X)限定的DNA杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(XII)与⑴限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。4.如权利要求1至3中任一所述的重组蓝藻，其特征在于所述产异丙醇的重组蓝藻I是将双链DNA甲通过同源重组导入蓝藻的基因组DNA得到的；所述双链DNA甲包括所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和所述醇脱氢酶的编码基因；所述产丙酮的重组蓝藻II是将双链DNA乙通过同源重组导入蓝藻的基因组DNA得到的；所述双链DNA乙包括所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因和所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因；所述产异丙醇的重组蓝藻III是将双链DNA丙通过同源重组导入所述产丙酮的重组蓝藻II的基因组DNA得到的；所述双链DNA丙包括所述醇脱氢酶的编码基因；所述产异丙醇的重组蓝藻IV是将双链DNA 丁通过同源重组导入蓝藻的基因组DNA得到的；所述双链DNA 丁包括所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因、所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因和所述醇脱氢酶的编码基因；所述产丙酮的重组蓝藻V是将双链DNA戊通过同源重组导入蓝藻的基因组DNA得到的；所述双链DNA戊包括所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因、所述乙酰乙酰辅酶A转移酶的编码基因和所述乙酰乙酸脱羧酶的编码基因；所述产异丙醇的重组蓝藻VI是将双链DNA已通过同源重组导入所述产丙酮的重组蓝藻V的基因组DNA得到的；所述双链DNA已包括所述醇脱氢酶的编...

【专利技术属性】
技术研发人员：周杰，张海峰，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11