红细胞生成素治疗家养和饲养动物贫血症制造技术

本发明专利技术涉及通过施用编码狗、猫和猪红细胞生成素的表达载体来治疗家养和饲养动物（特别是狗、猫和猪）贫血症的方法。此外，本发明专利技术还包括含有表达载体的药物组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用于家养和饲养动物的基因治疗方法。本专利技术特别涉及通过施用编码红细胞生成素的表达载体而治疗动物贫血症的方法，以及含有所述表达载体的药物组合物。由慢性肾衰竭、施用化疗药物或手术引起的贫血症是导致家养和饲养动物死亡和残废的一个主要原因。除了输血，目前可用于治疗狗、猫或猪贫血症的唯一方法是施用重组人红细胞生成素(EPO)。虽然这种治疗有可能提高动物的生活质量，但是它有两个主要的缺点。第一，这种治疗费用昂贵且不方便(动物一生中通常每周必须注射三次)。第二，接受治疗的动物经常产生针对人类蛋白质的抗体，从而降低其疗效，而且可能会与动物自身的EPO发生交叉反应，从而加剧贫血症(Cowgill等人，美国兽医学会杂志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)212521-528(1998))。最近狗型、猫型和猪型EPO的获得(Wen等人，血液(Blood)821507-1516(1993))可能会对克服由于跨种系施用EPO引起的免疫学影响有所帮助。然而，治疗很可能依赖昂贵且要求经常的重复。能避开这些问题的EPO给药方法将是兽医学领域的一项显著进步。本专利技术是建立在狗、猫和猪贫血症可以通过施用编码EPO的表达载体而减轻这一发现基础上的。这种载体在体内被细胞摄取，并在持久的一段时间内(3-4个月)产生足够量激素，以显著提高动物体内血球计数水平。通过使用编码在接受治疗的动物中发现的类型的EPO的载体(狗EPO给狗、猫EPO给猫和猪EPO给猪)，可以避免由于给这些动物施用人的EPO引起的免疫学问题。一方面，本专利技术涉及通过施用表达载体来治疗狗贫血症的方法，所述表达载体含有主要由编码狗红细胞生成素组成的独特EPO序列元件。术语“主要由…组成”指含有编码狗EPO的正确氨基酸序列的核酸序列，以及编码带有非实质性氨基酸差异的蛋白质的核酸序列，这种非实质性差异可由狗激素基本功能和免疫学特性的保留证明。在这一方面特别重要的是编码的EPO不引起接受治疗的动物体内产生抗EPO抗体。EPO序列元件编码成熟EPO蛋白的氨基酸序列，对于狗EPO而言，有166个残基。在它的N-末端通常地有一段信号序列(优选同源的信号序列)。术语“同源的信号序列”指与编码的EPO通常相关的信号序列，如狗EPO信号序列将优选地用于狗EPO结构序列。狗激素的完整氨基酸序列列于附图说明图1(SEQ ID NO1)。最初的26个氨基酸(图中标有下划线的)是狗信号序列，而剩余的氨基酸是成熟狗EPO的结构序列。用于治疗动物的表达载体应当优选含有与EPO序列元件可操作地连接的启动子元件。术语“可操作地连接”指两个序列元件(即启动子和EPO结构序列)通过这样一种方式连接，使得转录在启动子的控制下进行，并且EPO蛋白正确合成。应当给接受治疗的动物施用量足以引起其血球计数在统计学上显著增加的表达载体。已记载有许多不同的药物可用于增强施用的核酸在体内的细胞摄取。虽然这些药物都适合本专利技术，但是表达载体优选与阳离子脂质混合、作为脂质体的一部分或者以无转染促进药物的形式施用。表达载体通常应当以0.01-10mg/ml的浓度施用，优选的浓度约为0.1mg/ml。优选的送递方法是通过肌内注射，但是也可以使用其它方法，如通过“基因枪”的方法。本专利技术的另一方面，通过用猫EPO序列元件或猪序列元件取代表达载体中狗EPO序列元件，以上讨论的治疗贫血症的方法可以应用于猫和猪。这样，可以给猫施用含有主要由编码猫EPO的核苷酸组成、并与启动子元件可操作地连接的独特EPO序列元件的表达载体。对于猪而言，表达载体中的独特EPO序列元件将主要由编码猪EPO的核苷酸组成。类似狗，所编码的EPO的N-末端通常应当有一段信号序列，而且应当给接受治疗的动物施用量足以引起其血球计数在统计学上显著增加的表达载体。服用的表达载体优选与阳离子脂质混合，掺入作为脂质体的一部分，或者以是无任何转染促进药物的形式施用。猫EPO的序列列于图2(SEQ ID NO2)。图中标有下划线的氨基酸是猫信号序列。猪EPO的结构序列列于图3(SEQ IDNO3)。本专利技术还包括供肠胃外使用，含有上述狗、猫或猪表达载体的药物组合物。载体应当悬浮或溶解于水溶剂诸如盐溶液中，并且应当以约0.01-10mg/ml的浓度存在。优选的浓度约为0.1mg/ml。图1图1给出了狗EPO的完整氨基酸序列。标有下划线的氨基酸是狗信号序列，而剩余的氨基酸是成熟的狗EPO的结构序列。图2图2给出了猫EPO的完整氨基酸序列。标有下划线的氨基酸是猫信号序列，而剩余的氨基酸是成熟的猫EPO的结构序列。图3图3给出了成熟的猪EPO的完整结构序列。图4图4显示设计用来确定给狗施用狗EPO编码DNA的效果的研究结果。将狗分成几组，一组为对照，接受编码人可溶性胚胎碱性磷酸酶基因的质粒DNA(图中用黑菱形表示)，另有三个实验组。A组给予6剂于25ml体积中的7.5mg EPO DNA(图中用黑方框表示)；B组给予6剂于25ml体积中的2.5mg EPO DNA(图中用黑三角表示)；C组接受6剂于3ml体积中的2.5mg EPO DNA(图中用X表示)。对研究中的各只狗进行为期32天的血球计数。图5图5显示肾衰竭模型中给予狗EPO编码DNA的实验结果。16只狗经外科手术摘除一个肾，并使第二个肾减小约50％。间隔24小时给狗放血，诱导贫血症。最后一次放血后，总共12只狗接受编码狗EPO的DNA。其中6只狗接受无转染促进剂的DNA，另6只狗接受与脂质复合的DA。4只对照狗不进行处理。为期50天测定每只狗血球计数的百分比变化，图中显示了对照(黑方框)、用无转染促进剂的DNA处理的动物(圆圈，短划线)和用脂质复合DNA处理的动物(圆圈，点线)的结果。图6该图显示的也是附图5有关实验的结果。将对照动物和用脂质复合DNA处理的动物的数据用研究中约第12-38天观察到的血球计数变化表示。还显示了与这些数据有关的最佳直线的拟合。黑圆表示由脂质复合DNA处理的动物得到的结果，方框表示对照动物的结果。定义下面的描述使用了许多涉及重组体DNA技术的术语。为了能对说明书和权利要求书有清晰和一致的理解，提供下列定义。克隆载体在宿主细胞中可以自主复制、特征在于有一个或少量限制性内切酶识别位点的质粒、噬菌体DNA或其它DNA序列。外源DNA片段可在这些位点拼接到载体中，达到片段的复制和克隆。载体可含有适合用来鉴定转化细胞的标记。例如，标记有可能提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。表达载体与克隆载体类似、但能诱导克隆DNA在转化宿主后表达的载体。克隆的DNA常常处于调控序列诸如启动子或增强子的控制下(即与之可操作地连接)。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或抑制型的。宿主作为表达载体或克隆载体受体的任何原核或真核细胞即是那种载体的“宿主”。可以作为宿主的细胞的例子在本领域中为人所共知，用于细胞转化的技术同样众所周知(参阅，如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)第二版，冷泉港出版社(1989))。宿主细胞可在体内存在并且经受给动物注射的核酸的转染。启动子通常发现于基因的5’区域、位于起始密码子附近的DNA序列。转录自启动子起始本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗狗贫血症的方法，包括给所述狗施用表达载体，其中：ａ）该表达载体包括主要由编码狗红细胞生成素的核苷酸组成的独特ＥＰＯ序列元件；ｂ）该表达载体还包括与所述ＥＰＯ序列元件可操作连接的启动子元件；和ｃ）该表达载体以足够引起狗血球计数 在统计学上显著增加的剂量施用。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BR克里斯南，MG谢帕德，
申请(专利权)人：辉瑞产品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]