槐果碱作为制备柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的用途及其制法制造技术

本发明专利技术是一种对柯萨奇Ｂ病毒性心肌炎病因治疗药物－槐果碱的用途及其制法，它具有低毒而有明显对抗柯萨奇Ｂ病毒的生物合成（包括蛋白的合成）和进入细胞内发挥抗病毒作用的特点，其制造工艺亦具有成本低，药源丰富，制备方法操作简便，适用于大规模生产等特点。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术揭示一种治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的药物——槐果碱的用途及其制法，属于药物制造领域。国内病毒性心肌炎有日益增多趋势，据估计在一次急性病毒性感染中，约有5％的病人的心肌受染，在普通感冒中，有1/3患者可出现心电图异常。国外在常规尸检中约有3.4-9.3％的患者有局灶性或弥漫性心肌炎。若加用免疫荧光技术进行调查，则30％的心脏标本有柯萨奇B病毒抗原。本病的发病率仅次于冠心病，其病原病毒以柯萨奇B(CVB)病毒占首位(占60％以上)，其所致心肌炎临床表现轻重不一，重者可出现泵衰竭、严重心律失常，甚至猝死，有的突然出现心前区疼痛加剧，急性心肌梗死而危在旦夕，有的呈顽固性反复发作或临床表现呈不明显，但其潜在发展所致扩张型心肌病3/4于起病5年内死亡，后果十分严重。但近年来由于分子生物学引入本病的研究，认为本病的病因是由于“柯萨奇B病毒”持续感染所致。以上现状皆因迄今为止尚未发现对抗柯萨奇B病毒的有效药物所致，所以当务之急是寻找对抗柯萨奇B病毒的有效药物。对于病毒性心肌炎，目前所采用的治疗全为对症治疗，如葡萄糖、氯化钾、胰岛素、辅酶Q10、维生素、抗心律失常药物等。晚近曾有学者报导干扰素在实验小鼠感染CVB3的同时或感染后24小时内使用能有效地减轻心肌炎症状，而在病毒感染24小时后使用则未能阻止心肌炎病毒的增殖。三氮唑核苷虽能抑制病毒RNA的合成，但该药的有效治疗浓度对人体已有毒性。免疫抑制剂和环孢霉素等治疗小鼠急性病毒性心肌炎无有效报导，却有报导用此药物仅可使病情恶化。故以上述及的干扰素、三氮唑核苷、免疫抑制剂和环孢霉素等都不是有效的抗柯萨奇B病毒有效药物。为寻找对抗柯萨奇B病毒有效药物，我们通过实验从众多的中药中仅筛选出一味苦参，它低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的作用。已有技术中苦参是我国历史悠久的传统中药之一，无论是古代还是现代，对它的研究和应用一直是十分活跃的。苦参始载于我国最早的医学文献《神农本草经》，列为中品，具有清热燥湿、祛风杀虫的功能、主治心腹痞满胀气、症瘕积聚、黄疸，溺有余沥，逐水除痈肿，补中明目止泪，养肝胆气，安五脏，平胃气，令人嗜食、轻身、定志，益精利九窍，除伏热肠癖，止渴醒酒，小便赤黄，疗恶疮下部。我国药典一九七七年版及部分地方药品标本已将《苦豆草流浸膏片》收载主治菌痢及肠炎。晚近的动物实验证明，苦参生物碱对中枢神经有抑制、镇痛及降温作用，能提高机体免疫能力，并有抗癌作用。苦参提取物苦参生物碱能治疗乙肝，有改善临床症状及肝功能，使部分患者HbeAg转阴。有文献报导苦参生物碱具有平喘及抗心律失常的作用。江西南昌妇幼保健院曾用苦参生物碱治疗恶性葡萄胎112例。第三军医大学曾用苦参生物碱对254例喘息型慢性气管炎及支气管哮喘病人进行治疗，证明是一种有效的平喘药物，安全而副作用小。但至今未见苦参生物碱能对抗柯萨奇B病毒的作用及用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的报导。已有技术中，从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescensAit)及豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥根及其地面部分中所提取的物质，已可分离出20余种生物碱，其中有一种主要的生物碱是槐果碱(Sophocarpine)，分子式为C15H22ON2，熔点为53-54℃,D-32.9°,(t=15，乙醇)，结构式为 参见南京药学院《中草药学》编写组编《中草药学》(中册)，江苏人民出版社8月第一版，P494-495。本专利技术目的在于提出一种能用于治疗柯萨奇B病毒所引起的病毒性心肌炎对抗病因的有效药物的用途和制备方法。本专利技术的目的是通过下述技术方案来实现的我们通过体外以及Balb/c小鼠的柯萨奇B病毒性心肌炎的动物模型体内，从众多的中药中筛选出一味能对抗柯萨奇B病毒的苦参，在苦参的众多生物碱中再筛选出其有效成分——槐果碱，实验证明当其浓度在312ug/ml以下时对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有效果。当细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/m1至200ug/ml浓度间仍能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，对病毒血症期的小鼠能从血中清除柯萨奇B病毒95.63％-99％。通过3HdR掺入法、MTT比色法、结晶体染色法，证明槐柯碱在200-3.125ug/ml时对Hela细胞的DNA合成代谢、细胞能量合成代谢、细胞存活率都有不同程度的保护，与剂量呈正相关。对患CoxB病毒性心肌炎的小鼠如用槐果碱治疗，大于60％的小鼠均能存活50天以上，且心肌无病理变化，而不用药的对照组100％死于8天内，心肌细胞明显坏死伴淋巴细胞浸润，证实槐果碱是一种低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用，具有用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的用途，从而可以用来制备作为治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的药物。槐果碱作为柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的制备方法，其技术特征在于a．将苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；b．对总生物碱经甲苯萃取，并通过5-10％盐酸提取槐果碱；c．调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；d．溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；e．通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。本专利技术的技术方案通过实验研究结果如下(一)体外实验(1)建立微量细胞培养法显示槐果碱注射液浓度低于312ug/ml对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有保护作用。(2)建立病毒增殖减少试验表明细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/ml至200ug/m1浓度间均能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，说明槐果碱在体外试验中能抑制CVB的增殖，并呈一定的剂量依赖性。(3)建立SDS-PAGE电泳分离和Westernllot免疫印迹试验，通过微量细胞培养法，病毒蛋白质Westernllot，分析了槐果碱的不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100及200ug/ml)对病毒增殖和衣壳蛋白质含量的影响，表明槐果碱在体外试验中能抑制CVB3m的增殖，并呈一定的剂量依赖性。通过病毒吸附和穿入细胞前后槐果碱的比较，显示其能进入细胞内发挥抗病毒作用。它可能不影响CVB3m吸附、穿入等环节，而是影响CVB3m侵入细胞后某环节，特别是病毒的生物合成(包括蛋白的合成)。(4)3H-TdR(掺入法测定)(氚标记胸腺嘧啶核甘)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的DNA合成代谢的保护作用(见下表1)。(5)MTT微量检测法(甲基偶氮唑盐)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的能量代谢的保护作用(见下表1)(6)结晶紫染色法(crystol violet)测定槐果碱对cVB3m感染的Hela细胞存活率的保护作用(见下表1)。表1槐果碱对Hela细胞保护作用的测定MO 1:5 上表(表1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
槐果碱作为制备柯萨奇Ｂ病毒性心肌炎病因治疗药物的用途，它的结构式为：＊＊＊本用途的特征在于：槐果碱是一种低毒并具有明显对抗柯萨奇Ｂ病毒的生物合成（包括蛋白的合成）和进入细胞内发挥抗病毒作用，具有用于治疗柯萨奇Ｂ病毒性心肌炎疾病去除病 因的用途，从而可以用来制备作为治疗柯萨奇Ｂ病毒性心肌炎疾病去除病因的药物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曙霞，刘晶星，王平全，张军胜，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]