抗鼻咽癌靶向偶联制剂及其制备方法技术

本发明专利技术属于抗鼻咽癌药物领域。公开了抗鼻咽癌靶向偶联制剂，其包括：３００μＣｉ～６００μＣｉ由同位素［１８８］↑Ｒｅ和ＢＡＣ↓［５］偶联的靶向放疗药［１８８］↑Ｒｅ－ＢＡＣ↓［５］；２．５ｍｇ／ｋｇ由ＰＹＭ的和ＢＡＣ↓［５］偶联的靶向化疗药ＰＹＭ－ＢＡＣ↓［５］。在荷瘤小鼠上联合应用这二种靶向偶联制剂能达到使肿瘤完全消失又不影响实验动物生存的治疗效果。本发明专利技术还公开了这二种抗鼻咽癌靶向偶联制剂的制备方法。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗鼻咽癌药物，特别涉及抗鼻咽癌靶向偶联制剂及其制备方法。
技术介绍
鼻咽癌最常采用放射治疗，有远处转移患者还须进行全身化疗。即便如此，相当部分肿瘤患者的治疗仍然达不到预期的效果。究其原因，(1)目前微小转移灶的精确定位尚未解决，转移灶的局部放疗难于实施；(2)化疗未能有效杀灭癌细胞，(3)全身化疗造成骨髓细胞造血功能的抑制。为了解决这些问题，长期以来人们一直在探求新的技术。肿瘤靶向治疗就是一种理想的肿瘤治疗模式，也是当今肿瘤治疗的研究热点之一。该方法要求设计一种对肿瘤细胞有较高识别能力，能选择性地与癌细胞相结合，在有效杀伤癌细胞的同时又不致对骨髓细胞造血功能和机体造成损伤的靶向放疗/化疗药。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供抗鼻咽癌靶向偶联制剂，它能取得使肿瘤完全消失又不影响实验动物生存的治疗效果。本专利技术另一目的在于提供上述抗鼻咽癌靶向偶联制剂的制备方法。本专利技术目的是这样实现的该抗鼻咽癌靶向偶联制剂由以下所述药物组成由同位素188Re(铼)和抗鼻咽癌第5号单克隆抗体(monoclonal antibodyNo.5 anti-nasopharyngeal carcinoma cells，BAC5)偶联的靶向放疗药188Re-BAC5300μCi～600μCi；由平阳霉素(Pingyangmycin，PYM)和BAC5偶联的靶向化疗药PYM-BAC52.5mg/kg。本专利技术的另一目的是这样实现的上述抗鼻咽癌靶向偶联制剂的制备方法包括(1)提供纯化BAC5单抗；(2)提供A液SnCl2·2H2O+维生素C；和B液柠檬酸+酒石酸，将A液、B液和Na188Re发生器淋洗液混合；(3)双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)通过活泼酯组份与步骤(1)中BAC5蛋白的氨基反应形成含硫醇吡啶保护基的蛋白(BAC5-SPDP)；用二硫苏糖醇还原BAC5-SPDP，产生含巯基的蛋白(BAC5-SH)；将BAC5-SH与步骤(2)所得混合液反应制得188Re-BAC5；(4)将葡聚糖T-40与高碘酸钠溶于去离子水，室温下搅拌1小时，去离子水透析16小时，制得多醛基葡聚糖，冻干备用；将多醛基葡聚糖与PYM溶于磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)中，4℃避光搅拌4小时，再加入步骤(1)的BAC5，4℃搅拌13小时，最后加入1mg/ml的硼氢化钠，4℃搅拌2小时，终止反应，制得PYM-BAC5。附图说明图1是188Re-BAC5和PYM-BAC5联合治疗鼻咽癌(NPC)的肿瘤生长曲线；图2是低剂量组(A)实验动物的瘤体分析图；图3是PYM-BAC5组(E)实验动物的瘤体分析图； 图4是188Re-BAC5组(D)实验动物的瘤体分析图；图5是中剂量(B)和高剂量(C)联合用药组实验动物的瘤体分析图；图6是剥离后的瘤体图。具体实施例方式本专利技术的抗鼻咽癌靶向偶联制剂由以下所述药物组成由同位素188Re(铼)和抗鼻咽癌第5号单克隆抗体(monoclonal antibodyNo.5 anti-nasopharyngeal carcinoma cells，BAC5)偶联的靶向放疗药188Re-BAC5300μCi～600μCi；由平阳霉素(Pingyangmycin，PYM)和BAC5偶联的靶向化疗药PYM-BAC52.5mg/kg。本专利技术的抗鼻咽癌靶向偶联制剂的制备包括一、抗低分化鼻咽癌细胞株(命名为CNE-2)单克隆抗体的制备1.抗CNE-2细胞杂交瘤细胞株的建立以CNE-2细胞和非角化型鼻咽癌组织作为交互免疫原免疫Balb/c小鼠，按杂交瘤技术常规，使免疫小鼠的脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合，经选择性培养，特异性筛选及克隆化培养后获得可分泌抗CNE-2细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BAC5株。它所分泌的单抗称之为抗鼻咽癌细胞单克隆抗体(BAC5单抗)，将该株细胞接种于Balb/c小鼠腹腔可诱导含BAC5单抗的腹水。2.BAC5单抗的特异性鉴定经免疫扩散法测定，BAC5株杂交瘤细胞分泌的单抗属小鼠IgG1亚类，经LSAB(Labelled Streptavidin-Biotin system)免疫组化法测定，腹水抗CNE-2细胞效价＞1128000与人骨髓细胞呈阴性反应。取临床手术来源的冰冻切片为靶抗原，BAC5杂交瘤培养上清为一抗，辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体为二抗进行反应，鉴定BAC5单抗的特异性如下表1 BAC5单抗与正常鼻咽组织细胞的反应细胞类型 BAC5反应 正常小鼠血清应鳞状上皮细胞 - -柱状上皮细胞 + -上皮基底细胞 - -血管内皮细胞 - -淋巴细胞 - -表2 BAC5单抗与鼻咽癌组织细胞的反应鼻咽癌细胞 例数 BAC5反应(+) 正常小鼠血清(+)角化性鳞癌细胞 3 00非角化性鳞癌细胞 5050 0CNE-2细胞 1000 890 0上述结果说明非角化性鳞癌细胞来源于柱状上皮，BAC5单抗对来源于柱状上皮的非角化性鳞癌细胞(包含CNE-2细胞)有较高的特异性，它与人血细胞，骨髓细胞呈阴性反应。二、188Re-BAC5的制备1、应用硫酸铵沉淀/离子交换/亲和层析法从BAC5腹水中纯化BAC5单抗。2、采用柠檬酸—酒石酸—亚锡法将纯化后的抗体偶联188Re 反应过程A液SnCl2·2H2O15.0mg+维生素C100mg/1.5ml PBS(pH5.0) B液柠檬酸11.3mg+酒石酸 24.3mg/1.0ml PBS(pH5.0) 3、188Re-BAC5的制备SPDP中介的蛋白连接法1)双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)通过活泼酯组份与BAC5蛋白的氨基反应形成BAC5-PDP(含硫醇吡啶保护基的蛋白)；2)用二硫苏糖醇(DTT)还原BAC5-PDP，产生硫基化蛋白BAC5-SH(含巯基的蛋白)； 4、188Re-BAC5的鉴定1)用CNE-2细胞的放射结合量比较法鉴定188Re-BAC5的免疫活性2)用纸层析法检测放射化学纯度纸层析(两步法)第一步展开剂丙酮第二步展开剂生理盐水表3 不同亚锡(Sn-AA)量对188Re-BAC5放化纯度的影响Sn-AA 柠檬酸 PBS188ReO4展开剂188Re-BAC5放化纯度(A液) (B液) (ul) (ul)Rf＝0处的百分含量 (％)(ul) (ul) 丙酮 生理盐水10 10040 150 94.0％ 2.9％91.4％20 10030 150 97.6％ 4.25％ 93.2％30 10020 150 97.4％ 4.3％93.1％50 1000 150 91.4％ 5.0％86.4％表3提示当亚锡(Sn-AA)的量合适时，188Re-BAC5放化纯度可以达到93％。纯度可满足实验的要求。188Re-BAC5放射化学纯度＝(188Re-BAC5+188Re-胶体)％-188Re-胶体％。三、PYM-BAC5的制备1、应用硫酸铵沉淀/离子交换/亲和层析法从BAC5腹水中纯化BAC5单抗。2、葡聚糖T-40(dextran T-40)本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗鼻咽癌靶向偶联制剂，其特征在于：它由以下所述药物组成：由同位素［１８８］↑Ｒｅ和ＢＡＣ↓［５］偶联的靶向放疗药［１８８］↑Ｒｅ－ＢＡＣ↓［５］３００μＣｉ～６００μＣｉ；由ＰＹＭ和ＢＡＣ↓［５］偶联的靶向化疗药ＰＹＭ－ＢＡＣ↓［５］２．５ｍｇ／ｋｇ。

【技术特征摘要】
1.抗鼻咽癌靶向偶联制剂，其特征在于它由以下所述药物组成由同位素188Re和BAC5偶联的靶向放疗药188Re-BAC5300μCi～600μCi；由PYM和BAC5偶联的靶向化疗药PYM-BAC52.5mg/kg。2.权利要求1所述的抗鼻咽癌靶向偶联制剂的制备方法，其中包括(1)提供纯化的BAC5单抗；(2)提供A液SnCl2·2H2O+维生素C；和B液柠檬酸+酒石酸，将A液、B液和Na188Re发生器淋洗液混合；(3)SPDP通过活泼酯组份与步骤(1)BAC5蛋白的氨基反应形成BAC5-PDP；用DTT还原BAC5-PDP，产生BAC5-SH；将BAC5-SH与步骤(2)所得混合液反应制得188Re-BAC5；(4)将葡聚糖T-40与高碘酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长征，肖锡宾，张昌卿，吴涛，梁昌盛，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]