本发明专利技术专用于检测三类最常见的镰刀菌毒素，属于植物检疫技术领域，具体的说涉及一种镰刀菌毒素的分子检测技术领域。该方法根据镰刀菌基因组内与毒素合成密切相关的Ｔｒｉ１１基因，自行设计一组复合引物，从中国和国外采集得到的镰刀菌中检测分离得到镰刀菌毒素ＮＩＶ、１５ＡＤＯＮ和３ＡＤＯＮ的特异片段，该片段全长分别为６４３ｂｐ、４２４ｂｐ和３４２ｂｐ。本发明专利技术仅仅采用一组特异性引物，进行一次ＰＣＲ扩增反应，利用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，直接根据产物片断的长度，即可检测出禾谷镰刀菌产生的三种Ｂ型毒素的类型，本发明专利技术可应用于谷物、饲料和食品安全中毒素ＤＯＮ和ＮＩＶ污染的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术“ 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用”，专用于检测 三种类镰刀菌毒素，属于植物检疫
，与分子检测技术有关。
技术介绍
由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是危害小麦、大麦、燕 麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。19 世纪90年代，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病暴发成灾；近些年来，我国小麦赤霉病 也越来越严重，几乎蔓延到全国所有的小麦种植区，造成严重的产量损失和品质的大幅下 降。除此之外，更为重要的是镰刀菌产生的毒素能够使人畜中毒，严重威胁人畜健康，造成 食品安全上的重大隐患。欧美许多国家的啤酒和饲料加工企业明确提出所收购的大麦容忍 零毒素，我国也明确规定收购的大、小麦赤霉病粒率不得超过4%。镰刀菌可以产生单端孢霉烯族毒素(trichothecene)，他可以抑制真核细胞蛋白 质的合成，破坏人畜的免疫系统，使中毒者出现腹泻、呕吐和头晕等症状，而赤霉病麦中毒 是我国最主要的真菌毒素导致的食物中毒之一。在我国，禾谷镰刀菌是赤霉病的主要病原 菌(Fusariumgraminearum Schwabe)，近些年石if究表明F. graminearum是一个含有许多特 定种系的复合种(Fg complex)，0’ Donnell通过宗系谱法将Fg complex划分成12个特定 的正式命名的种。禾谷镰刀菌产生B型单端孢霉烯族毒素毒素，主要包括雪腐镰刀菌烯醇 (nivalenol，简称NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)，其中DON毒素 又具有两种衍生物，分别为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol，简 称3AD0N)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol，简称15AD0N)。 由于这三种镰刀菌毒素严重威胁到人类和动物的安全，国内外育种界、病理学界、医学界以 及各国政府检验检疫部门对这三种毒素的监测监控研究十分重视。镰刀菌毒素的检测主要有生物测定法、化学测定法、酶联免疫吸附法、特异性聚 合酶链式反应等手段。生物测定法由于没有统一的规范标准，并且有易污染、检测分析不 准确以及与毒素互作机制复杂等缺点，所以在实际镰刀菌毒素含量检测中未能得到广泛应 用。化学测定法是目前用于镰刀菌毒素定量测定的主要方法，具有是快速、准确、重演性 好的优点。但其纯化程序比较费时和复杂，技术含量要求也较高，不能满足口岸快速检测 的要求。酶联免疫吸附法操作简单，费用较低，但因为检测出的毒素中常含有一些其它衍 生物，所以测定的结果往往偏高。而且目前已有商品化的只有快速检测DON毒素的ELISA 试剂盒，还没有检测OTV的试剂盒问世，也不能区分DON毒素的两种衍生物。根据美国农 业部Ward博士的最新报道，产生3AD0N的镰刀菌具有更强的产孢率和生长速率，对麦类 作物的危害更为严重，并且正在取代产生其他毒素的镰刀菌，表现出更强的适应性(Ward， Τ.J. et al. 2008. An adaptiveevolutionary shift in Fusarium head blight pathogen populations is driving the rapid spread of moretoxigenic Fusarium graminearum in North America. Fungal Genet. Biol. 45 :473-484.)。在中国，我们也发现了类似的情况(Zhang et al. 2009. Population genetic analysis of Fusarium asiaticumpopulations from barley suggest a recent shift favoring 3ADON producers in southern China. Unpublished)。所以对于3AD0N和15AD0N的检测也是十分必要的。随着近年来国际贸易 中各国之间粮食进出口规模不断扩大，各国口岸都加强了对粮食作物的出入境管理，检疫 实践中急需一种套快速、简单、灵敏的检测方法来检测进出口粮食是否存在毒素污染。近年来随着分子生物学的快速发展，在镰刀菌毒素合成的基因表达调控方面取得 了一系列的重要进展，揭示了 trichothecen毒素合成途径中多个基因的作用。因此，国内 外研究者都希望通过这些分子生物学结果和相关基因的序列信息，找到一种简便、快速、 低成本的镰刀菌毒素检测方法。Kim等通过Tri5、Tril3和Tri7基因序列，检测分别来 自大麦、小麦和棉花的禾谷镰刀菌产生的毒素DON和NIV(Kim et al. 2003. Polymorphism of trichothecenebiosynthesis genes in deoxynivalenol-and nivalenol-producing Fusarium graminearum isolates. Myco 1. Res. 107 :190-197.)，但其中 Tri5 检测法涉 及Southern杂交，费用高，耗时长，难以在实际中推广应用。Chandler等通过Tri7和 Tril3基因检测了三种镰刀菌F. graminearu, F. cuImorum和F. cereali产毒情况，应用 了 10对引物，但DON和NIV特异片段长度不确定，而且较多的毒素检测结果相互之间 不吻合(Chandler et al. 2003. Development of PCR assays toTri 7 and Tri13 and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum， Fusarium culmorum， and Fusarium cerealis. Physiol. Mol. Plant Pathol. 62 :355-367.)。李和平等利用 Tri5_Tri6 基因间隔区序列设计一对引物，能够稳定的检测出禾谷镰刀菌产生的NIV和DON毒素 (Li et al. 2005. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and ηivalenol-chemotypes ofFusarium graminearum. FEMS Microbiol. Lett. 243 505-511.)，同时能够应用于小麦、玉米籽粒的检测，但仍然不能检测出DON毒素的两种衍 生物，并且只适用于禾谷镰刀菌，对于产生此类毒素的其他镰刀菌的检测并无说明。并且以 上方法由于DNA提取方法的限制，并不能真正满足快速检测的需求。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是研制一种能够快速准确检测镰刀菌本身产生毒素和 粮食、食品安全中镰刀菌毒素污染的分子检测方法，已达到快速、准确、低成本并且能够同 时检测出三种重要镰刀菌毒素(NIV，3AD0N和15AD0N)的目的，适用于禾谷镰刀菌复合种 本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测三类镰刀菌毒素的特异性引物四条，ｐｒｉｍｅｒ Ａ／Ｂ和ｐｒｉｍｉｅｒ Ｅ／Ｆ，其引物序列为： Ｐｒｉｍｅｒ Ａ：５’－ＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＴＡＧ－３’ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ：５’－ＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＴＣＣＧＴＡＴＴ－３’ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ：５’－ＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣ－３’ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄ：５’－ＴＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣ－３’ 其中ｐｒｉｍｅｒ Ａ／Ｄ引物对在产生雪腐镰刀菌烯醇（ＮＩＶ）毒素的镰刀菌中特异性扩增出６４３ｂｐ的产物，ｐｒｉｍｅｒ Ｂ／Ｄ引物对产生１５－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（１５ＡＤＯＮ）毒素的镰刀菌中特异性扩增出４２４ｂｐ的产物，ｐｒｉｍｅｒ Ｃ／Ｄ引物对产生３－乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（３ＡＤＯＮ）毒素的镰刀菌中特异性扩增出３４２ｂｐ的产物。
【技术特征摘要】
1.用于检测三类镰刀菌毒素的特异性引物四条，primerΑ/Β和primier E/F，其引物 序列为Primer A :5’ -CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’Primer B :5’ -AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’Primer C :5’ -GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’Primer D :5’ -TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3，其中primer A/D引物对在产生雪腐镰刀菌烯醇(OTV)毒素的镰刀菌中特异性扩增出 643bp的产物，primer B/D引物对产生15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15AD0N)毒素的镰 刀菌中特异性扩增出424bp的产物，primer C/D引物对产生3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯 醇(3AD0N)毒素的镰刀菌中特异性扩增出342bp的产物。2.一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法，其步骤包括1)从被测生物材料中抽提DNA，得到DNA样品；2)用权利要求1中的所示的引物对步骤1)中的DNA样品进行PCR扩增，得到权利要求 1中的特异性大小的DNA片段。3)用步骤2)的到的DNA片段，检测所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，冯洁，徐进，许景升，潘哲超，张力勍，田茜，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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