猪用二联疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者比例为１∶０．６－１．５。本发明专利技术还提供所述猪用二联疫苗的制备方法，其中包括转瓶培养单层细胞，接入种毒和病毒培养液，采用ＨＥＰＥＳ或ＮａＨＣＯ↓［３］缓冲系统调节培养液ｐＨ为７．４±０．２，病毒及培养液的接入量为３００－８００ｍｌ／１５Ｌ瓶；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒；将５０Ｖ佐剂与混合灭活抗原按１∶１体积比乳化，１１号白油或Ｍａｒｃｏｌ　５２油与混合的灭活抗原按１－２．０∶１体积比乳化配制成猪用二联疫苗。本发明专利技术便于超大规模生产，不限制毒株使用，缩小免疫剂量，同时确保免疫效力。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪用二联疫苗及其制备方法，特别是猪口蹄疫(FMD) 和猪呼吸与繁殖障碍综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 二联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
-口蹄疫作为国际兽医局(OIE)规定的A类动物流行病，是国际公认的对 畜牧业危害最大的动物传染病。因此，口蹄疫疫苗的研究一直受到国内外 的研究人员的高度关注。猪呼吸与繁殖障碍综合征虽是国际兽医局规定的B 类动物流行病，但最近一年来在我国发生了病毒变异，产生了高致病性毒 株，造成大量生猪死亡，重创了我国养猪业,使猪肉价格急剧增长。因此我 国政府最近高度重视该传染病，并与口蹄疫同等看待。目前正在积极开展 猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗的研究。国外对口蹄疫灭活疫苗的生产目前 主要采用悬浮培养技术培养细胞和病毒，其优点在于自动化程度高、质量 稳定性较高。其缺点在于这种培养病毒的方式病毒含量低，必须经过超滤 浓缩才能用于疫苗生产，这极大地限制了疫苗的产量。这种生产仅适用于 疫苗储备和小量免疫需要，不适合我国对口蹄疫免疫的大量需要，并且生 产设备和工艺成本很高，其产品价格使我国政府和用户都难以接受。某研 究所在本领域探索了多年，并在前进口了相应的设备，力图在口蹄疫疫苗 生产中使用，但最终不得不弃用，而仍使用目前的传统方法生产口蹄疫疫 苗。猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活疫苗的研究在国内外都有报道。由于猪 口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征以往在国内外很少同时造成危害，所以这两种疫苗都是单独研究、单独使用，目前国内外均没有将二者制成联苗 的报道。国内目前普遍采用传统的单层细胞培养病毒，其优点是无须国外的超 滤浓缩工艺，其培养的病毒含量就可以达到制备单价疫苗的要求，适合国内的超大规模生产的要求。申请人专利技术的93114885.5专利技术专利口蹄疫疫 苗的生产工艺，通过浓縮培养病毒使单价疫苗的效力大幅提高，目前在国 内广泛应用(国家科技专利技术二等奖)。其缺点是其仅适合做单价疫苗，做多 价联合疫苗则仍需进一步浓縮病毒，否则就只有提高使用剂量，这将加大 疫苗的副反应和增加使用难度。如进一步浓縮培养来浓縮病毒，则会遇到培 养基营养不足和细胞新陈代谢造成酸度增加，从而使合成出来的病毒大量 降解，这不但不能达到浓縮的目的，反而使有效病毒含量越来越少。因此 解决病毒培养中的营养问题和酸度问题是超浓縮培养的关键。由于猪口蹄 疫疫苗和猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗目前使用各自不同的佐剂，前者使 用双相佐剂,后者使用单相佐剂并且初步试验表明双相佐剂不适合于后者。 因此寻找对二者通用的佐剂也是该二联疫苗成败的关键。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上述技术问题，提供一种免疫力高，成本低廉的猪口 蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征二联疫苗，达到一针防两病的目的。 本专利技术的上述专利技术目的是通过如下技术方案实现的。 本专利技术提供一种猪用二联疫苗，其活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和呼 吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者比例为l: 0.6-1.5 (V/V)，优选 为l: 1。根据疫苗毒株效价高低配比，例如口蹄疫病毒规定效价是LDs么1075 LD5。/0.2ml，猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒效价规定为TCID5(^10LD5o/ml， 当口蹄疫病毒效价达到LD5(^10 LD50/0.2mWt，而猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒效价仍为规定的最底效价TCID5^10 LD50/ml，则二者的配比为l: 1.5。 二者反之也成立。所述二联疫苗还含有佐剂，所述佐剂为单相佐剂为矿物油且选自法国 SEPPIC公司Montanide ISA系列50V佐剂、含5%-10%的司本80和2%-5%的土 温80的杭州炼油厂11号白油或含5%-10%的司本80和2%-5%的土温80的美浮 公司Marcol 52油。所述50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭 活抗原按l: l体积比乳化配制，所述ll号白油或Marcol 52油与混合的猪口 蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2: l体积比乳化配制。本专利技术进一步提供一种所述的猪用二联疫苗的制备方法，其包括如下 工艺转瓶培养单层细胞，转速为8-12转/小时；单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液，其中所述病毒培养液对口蹄疫病毒为无血清的细胞培养液，对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒为含2%血 清的细胞培养液或完全细胞培养液，使用HEPES或NaHC03调整培养液pH 为7.4±0.2，病毒及培养液的接入量为300-800ml/15L瓶；转瓶中病毒培养液 加入量为300-600ml/15L瓶时，转瓶转速14±2转/小时，避免细胞处于干旱状 态；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒； 将50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭 活抗原按l: l体积比乳化，其中病毒液 11值为7.4±0.2; 11号白油或Marco152 油与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2.0: 1 体积比乳化配制成猪用二联疫苗。 其中种毒接入量为1 5%。其中所述病毒培养液pH值由NaHC03溶液微调至设定值，其中当病毒及 培养液的接入量为300-600ml/15L瓶时，培养液中加HEPES, NaOH ， NaHC03，并用NaHCO3溶液微调至pH7.4士0.2。其中当猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒培养液含血清超过2%时，收获的 病毒液用超滤浓縮器浓縮5-10倍，再用？11值为7.4±0.2的？88稀释回原来体 积。这样可尽可能祛除血清以减少过敏反应。如使用二个型的口蹄疫病毒，其中每个型的猪口蹄疫病毒培养其培养 液接入量为300-600ml/15立升细胞培养瓶，分别培养后将其混合灭活后用于 配制二联灭活疫苗。其中接入种毒和病毒培养液后转瓶转速为14±2转/小时。对口蹄疫部分的细胞培养和病毒繁殖工艺，其中出现细胞致病作用 (Cytopathogenic effect,CPE)后，收获病毒液,置-20。C保存。测定病毒效价， 乳鼠测定1^5^107化050/0.21111，细胞测定TCIDs^1085 TCID50/0.2ml。采用 振动膜除细胞碎片机除去细胞碎片，二乙烯亚胺(BEI)灭活病毒；对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒部分的细胞培养和病毒繁殖工艺，其 中出现细胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE)后，收获病毒液,置-2(TC保 存。测定病毒效价，细胞测定TCID^10LD5o/ml。采用振动膜除细胞碎片 机除去细胞碎片，二乙烯亚胺(BEI)或甲醛灭活病毒。本专利技术同现有技术相比具有如下优点本专利技术所提供的猪口蹄疫和呼吸与繁殖障碍综合征二联灭活疫苗制备 方法不限制使用的病毒株，不同的毒株通过调整病毒培养液的接入量和两 种抗原的配比都可以达到预期效果。而目前的现有技术都严格限制使用的 病毒株。因为毒株的免疫原性不同，对免疫原性不好的毒株唯一可以改变 其免疫效力的办法就是增加抗原含量。由于本方法有效地增加了病毒浓度， 因此可以通过调整配比(二种抗原的配比和抗原与油的配比)解决某些毒 株免疫原性不好的问题；本专利技术所提供的猪口蹄疫和呼吸与繁殖障碍综合征二联灭活疫苗的制备方法中病毒及其培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者体积比为１∶０．６－１．５。

【技术特征摘要】
1.一种猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者体积比为1∶0.6-1.5。2. 如权利要求l所述的猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，两者体积比为l: 1。3. 如权利要求1或2所述的猪用二联疫苗，其中所述二联疫苗还含有佐剂，所述佐剂为单相佐剂矿物油。4. 如权利要求3所述的猪用二联疫苗，其中所述矿物油选自法国 SEPPIC公司Montanide ISA系列50V佐齐!j、含5%-10%的司本80和2%-5%的 土温80的11号白油、含5。/。-10。/。的司本80和2。/。-5。/。的土温80的Marco1 52油。5. 如权利要求4所述的猪用二联疫苗，其中所述50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l: l体积比乳化 配制，所述ll号白油或Marcol 52油与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与 繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2.0: l体积比乳化配制。6. —种如权利要求1所述的猪用二联疫苗的制备方法，其包括如下工艺转瓶培养单层细胞，转速为8-12转/小时；单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液，加HEPES或NaHC03缓冲系 统调节培养液pH为7.4i0.2，病毒及培养液的接入量为300-800ml/15L瓶；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒； 将50V佐剂与混合的猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛景山，
申请(专利权)人：薛景山，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]