本发明专利技术提供确定样品中细胞、分析物、核酸或微生物是否存在的方法。本发明专利技术还提供发荧光的化合物和含有该发荧光化合物的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于测定的组合物、方法和试剂盒。更具体地讲， 或标记用于测定中的用途。
技术介绍
用于检测同源核酸序列最常用的分子生物学技术之一是核酸杂 交，即DNA/DNA、 RNA/RNA或RNA/DNA杂交。在这项技术中， 将用作探针的核酸(DNA或RNA)进行标记，然后使经过标记的核酸 与待检测核酸(DNA或RNA)杂交。当用作探针的核酸与待检测核酸 同源时，每条单链核酸与其互补序列杂交，以便形成双链序列，然 后通过标记探针检测双链序列。在许多医学分支学科中，独立地鉴定、标记、分离、修饰或者 测定血液中或其它生物体液中的分析物、樣i生物、氨基酸或核酸序 歹'J(例如多种病原体或多个基因或多个基因变异体)的需要日益明显。 大多数多种分析物测定法(例如检测多个核酸序列的测定法)，包括多 个步骤，灵敏度差，动态范围有限(通常大约相差2-100倍)和/或常常 要使用很复杂的仪器。在阐明人类基因组时，存在着进行实验的各种机会以确定特异 序列的存在、区别纯合子和杂合子的等位基因、确定突变的存在、 评价细胞表达图式等。在多数情况下，期望在一个反应内确定同一 样品的多个不同特征。许多测定中，确定特异序列的存在，不论是基因组序列、合成序列还是cDNA序列都是有益的。这些序列尤其 与基因、调节序列、重复序列、多聚体区、表达图式等有关。确定 一种或多种病原体的存在也同样有益。鉴定和定量测定可能分布于 DNA里摩的大量碱基或序列的需要，向我们提出了严峻的挑战。理 想的是，所用方法要精确，在限制所需试剂数量方面应适度经济和/ 或提供高度多重测定，允许鉴别和定量测定多个基因、和/或单核普 酸多态性(SNP)测定、和/或RNA或蛋白质水平上的基因表达。在早期药物开发测定中，放射性一直以来都是重要的读出信息。 然而，对更多信息、更高通量和小型化的需要引起了向荧光检测方 面的转变。基于荧光的试剂能够提供更有效的多参数测定，该测定 的通量和信息量较高，而需要的试剂和试验化合物的体积较小。与 基于放射性的方法相比，荧光方法既安全又便宜。用于检测生物化合物的另 一项技术是荧光原位杂交(FISH) (Swiger等(1996) Environ. Mol. Mutagen. 27:245-254; Raap (1998) Mut. Res. 400:287-298; Nath等(1997) Biotechnic. Histol. 73:6-22)。 FISH允 许检测预定的靶寡核苷酸，例如通过用例如显孩i镜目测细胞或组织 制备物中的DNA或RNA。因此，FISH在分子细胞遗传学、病理学 和免疫学等领域，在临床及研究实验室中，都是重要的工具。HSH 包括荧光标记寡核苷酸探针以检测特异性互补DNA或RNA序列。 准确地讲，FISH包括将寡核苦酸探针与含有或疑似含有耙寡核苷酸 的细胞或组织制备物温育，该探针包含与至少一部分靶寡核苷酸互 补的寡核苷酸。可检测标记(例如荧光染料分子)与寡核苷酸探针相结 合。杂交位点所产生的荧光信号通常可用落射荧光显微镜观测到。 另 一个方法是用与抗原(例如生物素或洋地黄毒苷(digoxygenin))缀合ii的寡核苷酸探针和针对该抗原的荧光标记抗体来显现探针与其DNA靶的杂交。许多FISH形式为本领域所知。参见例如Dewald等(1993)Bone Marrow Transplantation 12:149-154; Ward等(1993) Am. J. Hum.Genet 52:854-865; Jalal等(l998) Mayo Clin. Proc. 73:132-137; Zahed等(1992) Prenat. Diagn. 12:483-493; Kitadai等(1995) Clin. Cancer Res.1:1095-1102; Neuhaus等(1999) Human Pathol. 30:81-86; Hack等主编,(1980) Association of Cytogenetic Technologists CytogeneticsLaboratory Manual. (Association of Cytogenetic Technologists, San Francisco, Calif.); Buno等(1998) Blood 92:2315-2321; Patterson等(1993)Science 260:976-979; Patterson等(1998) Cytometry 31:265-274; Borzi等(1996) J. Immunol. Meth. 193:167-176; Wachtel等(1998) Prenat.Diagn. 18:455-463; Bianchi (1998)丄Perinat. Med. 26:175-185和Munne(1998) Mol. Hum. Reprod. 4:863-870。因此，用于鉴别和/或定量测定单基因或多基因、和/或SNP测 定和/或RNA或蛋白质水平上的基因表达的测定法，因其具有灵敏度 较高、动态范围大、荧光性较好、多重性程度较高和/或所用试剂较 少和较稳定，所以可以提高多分析物测定的简易性和/或可靠性，并 可以降低其成本。在测定领域内还存在着对具有以下特征的标记物的持续需要(i) 荧光强度高(用于小量检测)，(ii)吸收频率与发射频率之间适当分开， (iii)溶解度良好，(iv)易与其它分子连接的能力，(v)对极端条件和高 温的稳定性，(vi)用于多色去褶合的对称的、近似高斯发射线形 (Gaussian emission lineshape),和/或(vii)与自动化分析兼容。附图简述附图说明图1A至图1L表示鼠乳腺癌4T1细胞与本专利技术某些实施方案的 化合物一起温育(图1B、图1F和图1J)以及与Hoechst共染色使细胞 核染色(图1A、图1E和图II,蓝色)和与MitoTracker Deep Red共染12色使线粒体染色(图1C、图1G和图1K,图像中出现绿色)的共焦成 像。图1D表示图1A至图1C所示图像的重叠图像。图1H表示图IE 至图1G所示图像的重叠图像。图1L表示图II至图1K所示图像的 重叠图像。专利技术概述本专利技术的实施方案包括用于确定疑似含有细胞、分析物、核酸 或微生物的样品中细胞、分析物、核酸或微生物是否存在的测定法 (assay),所述测定法包括将样品与标记试剂混合以形成标记细胞、标 记核酸或标记樣t生物，所述标记试剂包括直接使细胞、分析物、核 酸或微生物染色以提供染色样品的染料，所述染色样品包括经染色 的细胞、分析物、核酸或-隊生物，其中所述染料是下式I所表示的化 合物I其中对于式I， NR,R2和服3114部分位于邻位、间位或对位；其 中X-为阴离子盐；其中R2、 113或114独立选自(^.10烷基(直链或 支链)、烯烃(直链或支链)，或者其中Ri和R2或者R3和R4与它们所 连接的氮原子结合在一起构成吡咯烷-l-基环或哌啶-l-基环；其中R5 为聚亚烷基二醇部分、C,，烷基(直链或支链)、烯烃(直链或支链)、 炔烃、取代和未取代的芳基、取代和未取代的千基和/或有机金属部 分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于确定样品中细胞、分析物、核酸或微生物是否存在或健康状况的测定法，所述测定法包括： 将样品与标记试剂混合形成标记的细胞、分析物、核酸或微生物，所述标记试剂包括使细胞、分析物、核酸或微生物染色以提供染色样品的染料，所述染色样品包括 经染色的细胞、分析物、核酸或微生物，其中所述染料是下式Ⅰ的化合物： ＊＊＊ Ⅰ 其中对于式Ⅰ，ＮＲ↓［１］Ｒ↓［２］和ＮＲ↓［３］Ｒ↓［４］部分位于邻位、间位或对位； Ｘ－为阴离子盐； Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］、Ｒ↓ ［３］或Ｒ↓［４］独立选自甲基、乙基、Ｃ↓［１－１０］烷基（直链或支链）、烯烃（直链或支链），或者其中Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］或者Ｒ↓［３］和Ｒ↓［４］与它们所连接的氮原子结合在一起构成吡咯烷－１－基环或哌啶－１－基环； Ｒ↓［５］选自 甲基、乙基、Ｃ↓［１－１０］烷基（直链或支链）、烯烃（直链或支链）、炔烃、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、有机金属化合物、聚亚烷基二醇部分、取代和未取代的芳基部分和取代和未取代的苄基部分；和 观测经染色的细胞、分析物、核酸或微生物的累 积。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JL塞尔夫，J沙马，JJ帕特里奇，RB克莱因，
申请(专利权)人：迈科索尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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