三聚ＩＬ－１Ｒａ制造技术

本发明专利技术包括融合蛋白的白介素－１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ），所述融合蛋白包含三聚域和ＩＬ－１Ｒａ多肽序列。所述融合蛋白是三聚复合物的一部分，所述复合物可用在治疗由ＩＬ－１介导的疾病的药物组合物中。本发明专利技术描述了对炎症性疾病如风湿性关节炎和糖尿病的有效治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由白介素1介导的疾病的治疗。更具体地，本专利技术涉及可用于治疗这 些疾病的白介素1受体拮抗剂(IL-IRa)。
技术介绍
IL-I家族是先天免疫系统的重要部分，其是适应免疫系统的调节剂。局部组织中 IL-I和IL-IRa之间的平衡影响炎症性疾病可能的发展，并导致结构损伤。在存在过量IL-I 时，炎症性和自免疫疾病可以在关节、肺、胃肠道、中枢神经系统(CNS)或血管中发展。已经 通过注射重组IL-IRa或通过基因疗法途径用IL-IRa进行人类疾病的治疗。已经证明用重 组IL-IRa可以治疗风湿性关节炎(RA)，并且正在进行对于骨关节炎(OA)的二期研究。过去的10年间，已经描述了 IL-I在很多人类疾病中重要的促炎作用。已经在多 种动物疾病模型中深入研究了 IL-I和IL-IRa之间的平衡，包括风湿性关节炎(RA)、骨关 节炎(OA)、炎症性肠病(IBD)、肉芽肿和纤维化肺疾病、肾疾病、肝脏和胰脏疾病、移植物抗 宿主疾病(GVHD)、白血病、癌症、骨质疏松症、糖尿病、中枢神经系统疾病、传染性疾病和动 脉疾病。在每种疾病中，局部过量产生IL-I和/或过少产生IL-IRa使受试对象容易患上 疾病。IL-IRa的治疗已经表明可有效预防组织损失(参见W.P.ArencbCytokine & Growth Factor Reviews,13(2002)pp. 323—240)。IL-I家族由下述组成两种激动剂，IL-I α和IL-I β ；特异性受体拮抗剂 IL-IRa ；和三种不同的受体，I 型 IL-IR(IL-IRI)、II 型 IL-IR(IL-IRII)和 IL-1 受体辅 助蛋白(IL-IRAcP)。IL-IRl是包括215个残基的长胞质域的SOkDa蛋白质。生物惰性的 IL-IRII是包括29个残基的短胞质域的60kDa蛋白质。在将IL-I α或IL-I β结合至单链 IL-IRl后，将IL-IR AcP募集至复合物。由接近的IL-IRl和IL-IR AcP的胞质域活化的信 号传导通路包括NF- κ B、JNK/AP-1和ρ38ΜΑΡ激酶途径。IL-IRII作为诱杀受体，在质膜上 结合IL-1，并且作为流体相中的可溶受体，从而防止IL-I与具有功能的IL-IRI相互作用。IL-I家族中的第三种配体，IL-IRa,是IL-I的结构变体，其可结合IL-1R，但是不 能活化细胞。IL-IRa是与IL-I α有18%氨基酸同源性并与IL_1 β有26%同源性的17kDa 蛋白质。IL-IRa最早描述的同工型分泌自单核细胞、巨噬细胞、中性细胞和其它细胞，并 且现在称为sIL-IRa。至今为止已经描述了 IL-IRa的三个其它细胞内同工型。IL-IRa的 ISkDa型，由可选的转录拼接机制从上游外显子产生，称为icIL-lRal，并且在角化细胞和 其它上皮细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、纤维原细胞和内皮细胞中发现。克隆自人白血球 的IL-IRa cDNA包含额外的63bp序列，作为cDNA的5，区域的插入序列。在单核细胞、巨 噬细胞、中性细胞和肝细胞中发现了 IL-IRa的15kDa同工型，称为icIL_lRa3，并且其可以通过可选的转录拼接以及通过可选的翻译起始而产生。可溶的IL-IRa和icIL_lRal同样很好地与IL-1R结合，但是icIL_lRa3表现出弱 的受体结合。IL-IRa通过结合IL-IRl但是防止IL-IR AcP与IL-IRI关联而作为特异性的 受体拮抗剂，其导致不能启动信号传导通路。诱杀受体IL-IRII结合质膜上并作为流体相中可溶受体的IL-1，防止IL-I与具有 功能的IL-IRI相互作用。因此，可溶的IL-IRII和IL-IRa能共同抑制IL-I。可溶的IL-Rl 能与IL-I以及IL-IRa结合，但是由于IL-I和IL-IRa之间的平衡，可溶的IL-IRI似乎作 为促炎剂而作用。KINERET .是来自Amgen的由大肠杆菌产生的IL_lRa，其已经表明对于活动性风 湿关节炎的患者有益。KINERET 需皮下注射，一日一次。皮下给药时，KINERET‘ 的半衰期 从4至6小时；对于i. v.给药，半衰期约为2. 5小时。通过肾清除而清除IL-IRa。KINERET 是IL-I的特异性受体拮抗剂，其通过存在的甲硫氨酸基团与天然发生的IL-I受体拮抗剂 相区别。在单独使用或与甲氨蝶呤组合使用时，由于临床征兆和症状的改善、放射学进展的 减缓和患者功能、疼痛与疲劳的改善，KINERET 已经表明对于患者有益。如临床试验所证 明的，KINERET⑧具有相当安全的特性。已经进行了几种尝试来改善IL-IRa较差的药物动力学。已经开发了仅靶向 IL-I β的抗体。然而，与IL-Ira相反，这些只阻断IL-I β，但是不能阻断IL-I α的作用。因此，本专利技术人发现了本领域中对于传递ILl-Ra的改善方法的需要，所述方法可 提供分子更长的半衰期，并提供相当安全的特性。附图说明图1表示四连蛋白家族的三聚结构元件的氨基酸序列比对。对应于残基V17至 Κ52的氨基酸序列(单字母编码)包含外显子2和人四连蛋白的外显子3的第一个三残基 (SEQ ID NO 59)；鼠科动物四连蛋白(SEQ ID NO 60)；分离自礁鲨软骨的四连蛋白同源蛋 白质(SEQ IDNO 61)和分离自牛软骨的四连蛋白同源蛋白质(SEQ ID NO :62)。七重复序 列中a和d位置的残基用黑体列出。列出的四连蛋白家族三聚结构元件的保守序列包括七 重复序列中a和d位置的残基，除了区域中其它保守残基之外，图中还表示出所述七重复序 列。“hy”表示脂肪族疏水残基。图2表示通过透析重折叠CII-H6-GrB-TripK-IL-lRa的结果。图 3 显示在 NiNTA 上捕捉 CII-H6-GrB-TripK-IL_lRa。图 4 是表示 GG-TripV-IL-IRa (trip V-IL-IRa)、GG-TripK-IL-IRa (trip K-IL-IRa) ,GG-TripT-IL-IRa (trip T-IL-lRa)和 GG-TripT-IL-lRa (trip T-IL-lRa)抑制 U937细胞中IL8的IL-I诱导的能力的图。图5是表示与非聚乙二醇形式和KINERET⑧相比，聚乙二醇TripT和TripV抑制 U937细胞中IL-8的IL-I诱导能力的图。图 6 是表示 PK 研究中使用的 TripT-IL-IRa、IlO-TripT-IL-IRa 和 V17-TripT-IL-lRa抑制U937细胞中IL-8的IL-1诱导的能力的图。图 7 是表示在大鼠中 i. v.注射 100mg/kg 后 TripT-IL-IRa、IIO-TripT-IL-IRa 和 V17-TripT-IL-lRa的血浓度的图。图 8 表示对于多批次 Met-I IO-TrpT-IL-IRa (LM022 和 LM023)和 GG-V17-TrpT-IL-1 Ra(CF019 和 CF020)蛋白质产量的 SDS-PAGE 分析。图 9 表示 Met-IlO-TrpT-IL-IRa 和 GG_V17-TrpT本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白，其包含三聚域和可抑制ＩＬ－１活性的ＩＬ－１Ｒａ多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：索尔L霍尔蒂特，米凯尔H安德森，约瑟夫斯D尼兰，
申请(专利权)人：阿纳福公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]