用于快速分析目标分析物并具有增强的灵敏度和特异度的逆向导流平台及其装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种用于快速分析目标分析物的逆向导流装置及其方法，所述装置包括：一个或多个反应室，各反应室包含一个或多个用于固定捕获分子的膜；控制元件，其可以被调节，以保持所述反应室处于受控条件；连接元件，其用于连接电源以及控制单元，该电源和控制单元能够调节并且保持所述的受控条件；以及液体输送元件，其能够引入并移除溶液，其中所述溶液被保持在与重力作用相反的方向流动的流动方向上，从而为分析物检测提供较高的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术公开了一种具有增强的灵敏度和特异度的新逆向导流杂交方法及其装置， 其用于利用阵列或其他模式快速、确定地识别不同的分析物。
技术介绍
导流杂交的原理是利用这样的正向导流机制，其中，诸如核酸分子等目标分子通 过厚度为约160微米的膜中的膜孔(0. 45微米)。使单股DNA与固定在膜孔中的相应捕获 用互补DNA或RNA序列紧密接触，从而能够以高的灵敏度和特异度而有效地检测目标序列。 已经反复证实，在其最初专利(美国专利No. 5，741，687)以及随后的报导中公开的正向导 流方法在灵敏度、效率、速度成本有效性以及使用友好性方面远优于常规的杂交方法。然 而，上述描述和公开的正向导流模式及其实施方案在实现最高可能性的灵敏度和特异度方 面尚未达到最优程度。利用逆向导流机制的本专利技术可以提供实质性的改进。在器官或脊髓移植中，通过DNA分析(如HLA分型)精确地进行基因分型对于在 捐献者和接受者之间进行配型(Thomas，1983)，从而防止产生急性移植物抗宿主病(GVHD) 是重要的。最近的研究表明，DNA基因分型可以产生更精确以及更准确的结果(Kaneshige 等，1993 ；Chow 和 Tonai，2003 ；Mach 等，2004)。HLA_A、B、DQ、DR 和 DP 基因分型提供用于精 确配型的数据，这对于选择潜在的器官捐赠者是需要的(Tam，1998 ；2004 ；2005 ；2006)。然而，在HLA复合体具有极高的异质性的情况下，通过DNA方法实现复杂的差异化 所需的多态SNP(单核苷酸多态性)的数量很多，这是因为很多SNP不会产生多态蛋白质。 因此，所表达的HLA蛋白的数量远低于SNP的数量。如果可以制作一组完整的抗体，则抗体 阵列和/或HLA抗原阵列组合对于HLA蛋白分型是最合适的，以便针对个体产生完整的HLA 谱图。目前，可以通过逆向基因工程和单克隆单体表达及筛选容易地得到这些抗体组合或 蛋白组合。根据所用抗体/抗原的数量，可以将分型类别设为较低(退化)至完全差异化。 实际上，标准的 HLA 血清分型(Kaneshige 等，1993 ；Chow 和 Tonai，2003 ；Mach 等，2004)已 经进行多年。本专利技术提供经改进的利用导流蛋白阵列模式的方法以及装置，以用于快速、有 成本效益的进行蛋白分析/分型。除了 HLA分型之外，还可以将斑点印迹、反向斑点印迹或 狭缝印迹用于其它蛋白体系，以进行快速分析。专利技术概述本专利技术提供一种用于快速分析核酸、蛋白质和/或所关注的任何分析物的逆向导 流装置，其包括一个或多个反应室，各个反应室包含一个或多个用于固定捕获分子的膜， 所述捕获分子能够以高的特异度和亲和度结合目标分析物；(b)控制元件，其可以被调节， 以保持所述反应室处于有利于特异性结合的受控条件；(C)连接元件，其用于连接电源和控制单元，该电源和控制单元能够调节并且保持所述受控条件；(d)液体输送元件，其能够 将溶液引入到反应室内，并且将溶液从反应室内移除；其中所述溶液沿着与重力作用相反 的方向流动，并且从膜的一端流到另一端而通过该膜，使得目标分析物通过固定在膜上的 捕获分子，从而为分析物检测提供最高的灵敏度。本文所述的逆向导流方法确保了溶液沿着与重力作用相反的方向从较低的水平 流向较高的水平。因此，可以在整个膜的侧面上从一端到另一端实现均勻的流速。这样，使 等量的样品通过固定在整个膜区域上的多种探针。结果，这会确保对由膜上的阵列中的相 应探针所捕获的同一样品中的不同分析物的相对定量测定的精确度。此外，采用沿着膜的 侧面上的流动方向会使目标分子的有效捕获率提高很多倍(参见下文专利技术详述中进行的 理论计算)。本专利技术还提供一种逆向侧面导流分析系统，其包括多个上述的逆向导流装置，其 中所述装置与电源和控制单元连接，所述电源和控制单元能够供应能量，并且独立地对装 置提供调节性控制。本专利技术还提供一种快速进行分析物检测的方法，该方法包括下列步骤(a)获得 含有目标分子的样品；(b)将样品施加到包含捕获分子的阵列上，所述捕获分子会在阵列 上捕获目标分子，其中所述样品沿着与重力相反的方向从阵列的一端流到另一端而通过该 阵列；以及(c)检测阵列上所捕获的目标分子。目标分子的代表性例子包括但不限于蛋白 质、核酸、肽或任何所关注的生物分子。附图简要说明附图说明图1示出本专利技术的杂交装置的分解图。图2示出本专利技术所述的逆向侧流反应室组件的另一个实施方案。图3示出常规用于临床诊断的蛋白癌症标志物。图4示出蛋白癌症生物标志物阵列的例子。面板A至D为一些癌症样品的谱图； 面板E为正常的样品。图5示出在逆向导流系统中所用的一些SNP阵列，以用于CYP2D6基因分型测定。图6示出测定CpG岛上的不同甲基化程度的方法；甲基化特异性PCR和导流杂交 分析。可通过二硫化物修饰来检测在DNA股链上是否存在甲基化，通过该方法CmG被转变 为TG，而未甲基化的CG保持不变。因此，可通过以下方法测定给定的CG岛上的TG与CG的 比例，所述方法为实时定量甲基化特异性PCR(MS-PCR或QMS-PCR)，或者进行共扩增，随后 用本文所述的甲基化特异性探针和未甲基化特异性探针进行杂交。在扩增后，如阵列A所 示，未甲基化的股链只会被未甲基化的探针所捕获，并且观察到。甲基化的股链会在阵列B 上观察到。在所有研究的基因都未甲基化的情况下，如阵列C所示，甲基化的斑点均不会显 示任何信号。另一方面，将会观察到与各基因中不同程度的甲基化相对应的各种谱图。如 果选择适当的基因组，人们可以将强度谱图的差异化与特定的疾病(如癌症)相关联。图7示出用于超甲基化阵列的候选基因。图8示出用于甲基化检测的一些引物和探针序列。图9示出用于甲基化分析的一些可用的标志物基因，以及其与癌症的可能相关 性。图10示出一步杂交方法的流程图。图11示出导流方法的另一个实施方案在导流捕获目标分析物之前在溶液中进 行的杂交反应。专利技术详述本专利技术提供用于快速检测分析物如蛋白质、核酸以及具有生物意义的特定的大分 子和小分子的方法和装置，条件是能够找到捕获用分子，并且将其用于捕获相应的目标物。 概括而言，本专利技术公开的装置是逆向导流装置，其包括(1) 一个或多个反应室，各个反应 室包含一个或多个膜或阵列，所述的膜或阵列具有被设计为捕获目标分子的捕获探针；以 及(2)输送系统，通过该系统可以将液体引导流过膜，以使目标分子与探针反应，并且未结 合的分子可以通过洗涤除去，或者用适当的机制如溶液泵排出。在另一个实施方案中，排出 体系可以是能够在反应后从反应室中吸附足量的液体的任何材料。如果捕获加合物本身不 产生信号，则应加入诸如亲和_酶偶联物(例如，抗生物素蛋白-HRP或抗体-AP等)等用 于产生颜色的附加成分，以进行信号扩增和检测。为了提高检测的灵敏度，含有目标分子的 样品溶液可被再循环通过阵列或膜，以重复捕获过程。本专利技术的新颖性(其不能为现有技术中公开的其他导流体系所实现)在于(1) 可以容易地实现沿着膜的整个长度均勻的流过，因为通过沿着与重力作用相反的方向从较 低水平向上流动会水平地保持液前(solvent front)为一条直线，以及防止气泡被捕获在 膜中的可能性，从而确保了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析分析物的逆向侧面导流装置，其包括：（ａ）一个或多个反应室，各个反应室包含一个或多个用于固定捕获分子的膜，所述捕获分子能够捕获目标分析物；（ｂ）控制元件，其可以被调节，以保持所述反应室处于受控条件；（ｃ）连接元件，其用于连接电源以及控制单元，该电源和控制单元能够调节并且保持所述的受控条件；（ｄ）液体输送元件，其能够将包含所述目标分析物的溶液引入到所述反应室内，并且将该溶液从所述反应室内移除；其中所述溶液被保持在与重力作用相反的方向流动的流动方向上，并且所述溶液从该膜的一端流到另一端而流过该膜，使得所述目标分析物通过固定在所述膜上的所述捕获分子，从而为分析物检测提供较高的灵敏度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-10-3 60/977,367一种用于分析分析物的逆向侧面导流装置，其包括(a)一个或多个反应室，各个反应室包含一个或多个用于固定捕获分子的膜，所述捕获分子能够捕获目标分析物；(b)控制元件，其可以被调节，以保持所述反应室处于受控条件；(c)连接元件，其用于连接电源以及控制单元，该电源和控制单元能够调节并且保持所述的受控条件；(d)液体输送元件，其能够将包含所述目标分析物的溶液引入到所述反应室内，并且将该溶液从所述反应室内移除；其中所述溶液被保持在与重力作用相反的方向流动的流动方向上，并且所述溶液从该膜的一端流到另一端而流过该膜，使得所述目标分析物通过固定在所述膜上的所述捕获分子，从而为分析物检测提供较高的灵敏度。2.权利要求1所述的装置，其中所述电源和控制单元能够供应能量，并且提供调整的 控制，从而保持所述反应室处于所述受控条件。3.权利要求1所述的装置，其中所述控制元件是加热和冷却元件。4.权利要求1所述的装置，其中所述膜包含选自由硝基纤维素、尼龙、碳氢化合物、 Biodyne或Porex所组成的组中的材料。5.权利要求1所述的装置，其中将所述溶液引入反应室并且从中移除是通过调节性液 体泵送而实现的。6.权利要求5所述的装置，其中所述液体泵送被用于使含有所述目标分析物的溶液循 环通过所述膜。7.权利要求1所述的装置，其中所述反应室能够容纳可拆卸的膜阵列单元。8.一种逆向侧面导流分析物分析系统，其包括1个以上的权利要求1所述的导流装置， 其中所述装置与电源盒控制单元相连，所述电源和控制单元能够供应能量，并且对所述装 置提供调整的控制。9.权利要求8所述的系统，其中所述的各个导流装置是通过所述电源和液体输送控制 单元独立进行控制的，从而使得各装置能够在不同的条件下进行不同的分<析。10.权利要求1所述的装置，其中所述目标分析物选自由蛋白、核酸以及包含经修饰的 碱基的核酸所组成的组。11.一种对目标分析物进行快速分析的方法，该方法包括下列步骤(a)获得含有目标分析物的样品；(b)将所述样品施加到阵列上，所述阵列包含用于会在该阵列上捕获所述目标分析物 的捕获分子，其中所述样品沿着与重力相对的流动方向从所述阵列的一端流到另一端，从 而流过所述阵列；以及(c)检测所述阵列上所捕获的目标分析物。12.权利要求11所述的方法，其中所述目标分析物选自由蛋白分子、核酸分子以及蛋 白和核酸分子的组合所组成的组。13.权利要求12所述的方法，其中所述蛋白分子来源于人、细菌或病毒。14.权利要求13所述的方法，其中所述人患有癌症或怀疑其患有癌症。15.权利要求12所述的方法，其中通过以下方法检测所述蛋白分子，所述方法选自由 荧光标记物、量子点标记、胶体金颗粒标记、磁颗粒标记或酶联底物分析所组成的组。16.权利要求11所述的方法，其中在将所述样品施加到所述阵列之前，将该样品与信 号产生剂混合。17.权利要求11所述的方法，其中将所述样品以导流的方法施加到权利要求1的装置上。18.权利要求11所述的方法，其中将所述样品以导流的方式施加到权利要求8的装置上。19.权利要求11所述的方法，其中所述目标分析物为核酸分子，并且所述方法在步骤 (b)之前还包括以下步骤(i)将所述核酸分子与第一探针和第二试剂相混合，其中所述第一探针会与所述核酸 分子结合，并且所述第二试剂会结合所述第一探针，从而在溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭荣安，
申请(专利权)人：达雅高生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]