注射果蝇属胚胎制造技术

本发明专利技术提供允许可靠地多重转化果蝇属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚胎的系统。本发明专利技术提供允许制备注射质量的核酸样品并允许同时制备多个所述样品的方法和试剂。本发明专利技术提供同时处理多个所注射胚胎的系统。本发明专利技术提供转化果蝇属胚胎的方法，所述方法包含使用处女品系（ｖｉｒｇｉｎａｔｏｒ?ｓｔｒａｉｎ），这些品系可用于增加建立产生注射用卵所需的杂交和筛选转化体所需的杂交的效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】注射果蝇属胚胎相关申请案本申请案主张2007年11月20日申请的美国专利申请案 U. S. S. N. 11/943, 180 ( ‘ 180申请案”)的优先权。'180申请案的全部内容以引用的方 式并入本文中。
技术介绍
1982 年，杰拉尔德·鲁宾(Gerald Rubin)和艾伦·斯布拉丁(Allan Spradling) 报导了通过注射具有转座因子载体的胚胎来实现果蝇属(Drosophila)遗传转化的系统的 发展(参见斯布拉丁和鲁宾，1982，科学(Science)，218 :341 ；和鲁宾和斯布拉丁，1982，科 学，218 348 ；都以引用的方式并入本文中)。此项工作仍然是分子生物学中胚胎的研究之 一。实际上，25年后，转化果蝇属的技术实质上仍然未发生改变。然而，尚有改进的空间。用不同的核酸制剂观测到广泛变化的成功率，且此过程为 劳动密集的。一般说来，一次只有少数胚胎可获得处理，因此“高通量”果蝇属转化是不可 能的。目前，正在尝试使果蝇属注射过程中的某些步骤自动化；研究人员已经指出，如果 可以研发出自动化系统，那么其希望能够实现2. 5小时内高达350个胚胎的注射速率。因此，所属领域中需要有效地注射果蝇属胚胎而无需自动化的系统和方法。所属 领域中需要注射果蝇属胚胎且增加所注射胚胎的存活率和转化率的系统和方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种快速且有效地将核酸引入果蝇属胚胎中，从而允许可靠地同时处 理多个胚胎的系统。本专利技术系统可允许快速地处理大量胚胎。举例来说，在一些实施例中， 本专利技术提供允许每分钟注射约8至10个胚胎的多重系统(multiplexed system)。在一些 实施例中，每分钟可注射超过10个胚胎(例如11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、 18个、19个、20个或更多)胚胎(例如，如果多个个体同时将胚胎排成行进行注射)。在一 些实施例中，本专利技术的多重系统可实现所注射胚胎的高达约50%百分比注射存活率。在一 些实施例中，生育率高达所注射存活者的85% -90%。在一些实施例中，本专利技术的多重系统 实现所注射胚胎的高达约80%注射转化率。在一些实施例中，存活率视所注射核酸的尺寸而定。在一些实施例中，存活率取决 于是利用随机插入基因组中(例如P因子介导的插入)的核酸还是利用以位点特异性方式 插入基因组中(例如6C31介导的转化)的核酸来尝试转化。举例来说，对于在约28kb至 约30kb范围内的核酸构建体，在本专利技术的多重策略中利用Φ C31整合酶系统可使所有所注 射胚胎的约30 %至约70 %为可育存活者。相比之下，在其它转化策略下利用cpC31整合酶系 统的人通常报导所有所注射胚胎的约20%至约50%为可育存活者。在本专利技术的多重策略中利用P因子介导的系统和在相同尺寸范围内的核酸可使 所有所注射胚胎的约30%至约70%为可育存活者。相比之下，在其它转化策略下利用P因子介导的系统的人通常报导所有所注射胚胎的约30%至约50%为可育存活者。对于甚至大于约30kb的构建体，随机转化与位点特异性转化下的存活率皆减小。 然而，随机插入系统的存活率减小比位点特异性插入系统快得多。对于小于约28kb的构建体，利用本专利技术策略可使所有所注射胚胎的约30%至约 70%为可育存活者。相比之下，利用其它转化系统的人通常报导所有所注射胚胎的约10% 至约50%为可育存活者。 对于小于约28kb的P因子构建体，利用本专利技术的多重策略可使所有所注射胚胎的 约30%为转化体。值得注意的是，利用传统方法进行P因子介导的转化可使所有所注射胚 胎的约30%为转化体。对于大于约30kb的P因子构建体，本专利技术方法和/或传统方法使转 化率适度至显著减小。对于具有低于约40kb的任何尺寸的整合酶构建体，利用本专利技术的多重策略可使 所有所注射胚胎的约20%至约85%为转化体。值得注意的是，当整合酶以转基因的形式提 供时，利用传统方法进行整合酶介导的转化可使所有所注射胚胎的约20%至约80%为转 化体(比肖夫(Bischof)等人，2007，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA), 104 3312 ；以引用的方式并入本文中)。对于具有低于约40kb的任何尺寸的整合酶构建 体，当整合酶以mRNA分子的形式提供时，利用传统策略可使所有所注射胚胎的约10%为转 化体(维根(Venken)等人，2006，科学，314 1747 ；以引用的方式并入本文中)。对于大于约40kb或约50kb的整合酶构建体，当整合酶以mRNA分子的形式提供 时，利用传统方法进行整合酶介导的转化可使所有所注射胚胎的约2%至约4%为转化体 (维根(Venken)等人，2006，科学，314 1747 ；以引用的方式并入本文中)。利用整合酶介导 的方法，使用本专利技术的多重系统和方法，可注射约IOOkb或甚至更大的构建体且可产生显 著增加数目的转化体(例如超过10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或更多)。因此，本专利技术提供转化果蝇属胚胎的系统和方法，其更快、通量更高且可更大规模 地进行。本专利技术的多重系统和方法的转化频率等于或大于传统(例如非多重)方法。本发 明提供允许实质上增加果蝇属胚胎转化效率(例如，如通过每分钟注射时间的转化体数目 来测量)的系统和方法。本专利技术代表对传统方法的显著改进。在一些实施例中，存活率和转化率可视注射至果蝇属胚胎中的特定核酸而 定。在一些实施例中，转化率可视所注射构建体的核苷酸序列而定。在一些实施例中， 转化率可视载体的核苷酸序列而定。举例来说，本专利技术涵盖以下认知，即具有绝缘序列 (insulatorsequence)的构建体的转化率通常低于不具有绝缘序列的构建体。在一些实施 例中，转化率可视插入特定载体中的核苷酸序列而定。举例来说，插入特定载体中的核苷酸 序列X可能或多或少比插入同一载体中的核苷酸序列Y有效地转化。关于DNA序列可影响 转化率的实例，参见格林布拉特(Grinblat)等人(1994，发育(Development)，120 91 ；以 引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，用于整合酶介导的转化的方法利用所注射mRNA作为整合酶来 源(参见例如格罗思(Groth)等人，2004，遗传学(Genetics)，166 1775 ；和费希(Fish)等 人，2007，自然实验手册(Nat. Protocols)，2 :2325 ；都以引用的方式并入本文中)。在一些 实施例中，用于整合酶介导的转化的方法将种系特异性转座(transpose)用于整合酶来源 (参见例如比肖夫(Bischoff)等人，2007，美国国家科学院院刊，104:3312;以引用的方式并入本文中)。本专利技术的系统和方法利用nanos-整合酶(nanos-integrase)转基因(比 肖夫(Bischoff)等人，2007，美国国家科学院院刊，104 3312 ；以引用的方式并入本文中)。 本专利技术涵盖以下认知，即通过表达转基因的整合酶提供整合酶使得转化率比以所注射mRNA 的形式提供整合酶的情况下高。本专利技术尤其提供允许快速且可靠地制备注射质量的核酸样品的方法和试剂。另 夕卜，本专利技术提供一种用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其包含以下步骤：获得多个不同的核酸样品以供注射至果蝇属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚胎中；和每分钟注射至少８个胚胎，使得至少３０％所注射胚胎存活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-11-20 11/943,180一种方法，其包含以下步骤获得多个不同的核酸样品以供注射至果蝇属(Drosophila)胚胎中；和每分钟注射至少8个胚胎，使得至少30％所注射胚胎存活。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少5个不同的核酸样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少10个不同的核酸样Pm o4.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少25个不同的核酸样Pm o5.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少50个不同的核酸样Pm o6.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少100个不同的核酸样Pm o7.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少250个不同的核酸样Pm o8.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少500个不同的核酸样Pm o9.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤包含获得至少1000个不同的核酸样Pm o10.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个内的个别核酸样品含有相同的核酸构建体。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个内的每个核酸样品含有不同的核酸构建体。12.根据权利要求1所述的方法，其中约40%所注射胚胎存活至成年期。13.根据权利要求1所述的方法，其中约50%所注射胚胎存活至成年期。14.根据权利要求1所述的方法，其中约60%所注射胚胎存活至成年期。15.根据权利要求1所述的方法，其中约70%所注射胚胎存活至成年期。16.根据权利要求1所述的方法，其中约80%所注射胚胎存活至成年期。17.根据权利要求1所述的方法，其中约90%所注射胚胎存活至成年期。18.根据权利要求1所述的方法，其中约100%所注射胚胎存活至成年期。19.根据权利要求1所述的方法，其中至少30%所注射胚胎变成可育成体。20.根据权利要求19所述的方法，其中约40%所注射胚胎变成可育成体。21.根据权利要求19所述的方法，其中约50%所注射胚胎变成可育成体。22.根据权利要求19所述的方法，其中约60%所注射胚胎变成可育成体。23.根据权利要求19所述的方法，其中约70%所注射胚胎变成可育成体。24.根据权利要求19所述的方法，其中约80%所注射胚胎变成可育成体。25.根据权利要求19所述的方法，其中约90%所注射胚胎变成可育成体。26.根据权利要求19所述的方法，其中约100%所注射胚胎变成可育成体。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含 穿过完整的卵壳注射。28.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含 注射至未干燥的胚胎中。29.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得步骤另外包含纯化所述核酸样品。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述纯化步骤包含 使所述核酸样品结合至过滤器；用洗涤缓冲液洗涤所述过滤器； 施加真空至所述过滤器的底部； 将所述过滤器离心；和 施加真空至所述过滤器的顶部；和 使所述过滤器空气干燥。31.根据权利要求30所述的方法，其另外包含用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述核 酸样品的步骤。32.根据权利要求31所述的方法，其另外包含重复所述洗脱步骤至少一次的步骤。33.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40yl与约80 yl之间 的洗脱缓冲液进行。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约40yl的洗脱缓冲液进行。35.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约50yl的洗脱缓冲液进行。36.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约60yl的洗脱缓冲液进行。37.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约70yl的洗脱缓冲液进行。38.根据权利要求31所述的方法，其中所述洗脱步骤是使用约80u 1的洗脱缓冲液进行。39.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约20°C与约23°C之间范围内的温 度下进行。40.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约20°C的温度下进行。41.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约21°c的温度下进行。42.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约22°C的温度下进行。43.根据权利要求1所述的方法，其中所有步骤都在约23°C的温度下进行。44.根据权利要求1所述的方法，其中所述注射步骤包含射入对应于胚胎直径的1/4与 1/2之间的体积的核酸制剂。45.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约8个胚胎。46.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约10个胚胎。47.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约12个胚胎。48.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约15个胚胎。49.根据权利要求1所述的方法，其中每分钟注射约20个胚胎。50.根据权利要求1所述的方法，其中每个核酸样品都包含至少一个能够进行P因子介导的转化的构建体。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约50kb。52.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约10kb。53.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约20kb。54.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约30kb。55.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约40kb。56.根据权利要求50所述的方法，其中所述构建体为约45kb。57.根据权利要求50所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动转座酶表达的构 建体。58.根据权利要求1所述的方法，其中每个核酸制剂都包含能够进行整合酶介导的转 化的构建体。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约10kb至约150kb。60.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约10kb。61.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约25kb。62.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约50kb。63.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约75kb。64.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约lOOkb。65.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约125kb。66.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体为约150kb。67.根据权利要求58所述的方法，其中所述构建体包含至少一个attB位点。68.根据权利要求58所述的方法，其中每个核酸制剂都另外包含驱动整合酶表达的构 建体。69.一种方法，其包含以下步骤获得核酸制剂以供多次注射至果蝇属胚胎中；使所述制剂经受纯化，其包含以下步骤使所述制剂结合至过滤器；用洗涤缓冲液洗涤所述过滤器；施加真空至所述过滤器的底部；将所述过滤器离心；和施加真空至所述过滤器的顶部；和使所述过滤器空气干燥；用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述制剂；和重复所述洗脱步骤至少一次。70.一种方法，其包含以下步骤获得多个核酸制剂以供注射多个构建体至果蝇属胚胎中； 使所述多个核酸制剂经受纯化，其包含以下步骤 使每个核酸制剂结合至过滤器； 用洗涤缓冲液洗涤每个过滤器； 施加真空至每个过滤器的底部；将每个过滤器离心；和 施加真空至每个过滤器的顶部；和 使所述过滤器空气干燥；用洗脱缓冲液从所述过滤器洗脱所述多个核酸制剂；和 重复所述洗脱步骤至少一次。71.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂提供在96孔板上。72.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少5个不同的核酸制剂。73.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少10个不同的核酸制剂。74.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少25个不同的核酸制剂。75.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少50个不同的核酸制剂。76.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少100个不同的核酸 制剂。77.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少250个不同的核酸 制剂。78.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少500个不同的核酸 制剂。79.根据权利要求70所述的方法，其中所述多个核酸制剂包含至少1000个不同的核酸 制剂。80.根据权利要求70所述的方法，其中每个核酸制剂都包含至少一个能够进行P因子 介导的转化的构建体...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏珊B祖斯曼，迈克尔特罗杰，
申请(专利权)人：遗传服务公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]