生产重组生物产品的方法技术

生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，包含下述步骤：在细胞培养初期制备哺乳动物生产细胞的生物量，一旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一种或多种表１中的ｍｉＲＮＡ分子水平的增加。该方法也可以包含下述步骤：在培养初期开始时或在培养初期过程中，增加哺乳动物生产细胞内一种或多种表１中的ｍｉＲＮＡ分子的抑制剂的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物的方法，和使用CHO 细胞培养物生产重组生物药物产品的方法。本专利技术也涉及重组CHO细胞系。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是用于生产药用重组蛋白质的最广泛使用的细 胞系，而且涉及CHO变体的方法占大量年收入(Andersen和Krummen, 2002)。 尽管缺少完全测序的基因组，已经使用非-CHO阵列(Baik等人，2006)或专 有的CHO cDNA阵列(Wong等人，2006 )进行了许多重要的CHO转录特性 研究。这些研究已经描述了在CHO培养过程中低温和诱导细胞凋亡的效应。 类似地，许多蛋白质组学研究已经研究了 CHO的蛋白质组和培养条件例如温 度引起的蛋白质表达的变化(Baik等人，2006; Champion等人，1999; VanDyk 等人2003; Kaufmann等人，1999; Lee等人，2003)。这些研究已经增加了对 CHO功能的调节的总体理解，特别是对于降温效应。已经证实，重组生产CHO细胞系的低温培养会导致持续的生存力和增加 的比生产力(Al-Fageeh等人，2006; Fogolin等人，2004; Furukawa和Ohsuye, 1998; Kaufmann等人，1999)，同时维持产物质量标准(Fogolin等人，2005; Yoon等人，2003b )。降低培养温度的最明显的结果是生长速率的立即降低，其 它效应包括降低的代谢(葡萄糖消耗，氧摄入，乳酸&铵生成)和增加的对剪 切力和细胞凋亡的抗性(Chuppa等人，1997; Furukawa和Ohsuye， 1998; Moore 等人，1997; Yoon等人，2003a)。生长速率的降低与在细胞周期的Gl期的细 胞的积累有关(Hendrick等人，2001; Kaufmann等人，1999; Yoon等人，2003a， b)，并且，已经将G1期停滞与增加的生产力相关联(Fussenegger, 2001 )。由于上面列出的原因，许多细胞培养方法釆用双阶段培养，通过使细胞在37'C生长，以使生物量最大化，然后将细胞转至低温，以促进蛋白质生产，同时维持更长的且更有活力的静止/生产期(Fogolin等人，2004, 2005; Butler，2005; Fox等人，2004)。两种在变温后诱导的最熟知的蛋白质是冷诱导的RNA结合蛋白质(CRIP)和RMB3。其中，已知CRIP会在低温条件下造成生长停滞(Danno等人，2000; Nishiyama等人，1997, Sonna等人，2002)。但是，总体而言，关于哺乳动物细胞如何对低温作出响应知之甚少。miRNAs是在翻译水平调节基因表达的小的( 22个核苷酸)非编码的RNAs(ncRNAs)。每个miRNA表面上调节多个基因，预期在哺乳动物中存在数百个miRNA基因(Lim等人2003 )。 1993年在秀丽隐杆线虫(C. elegans )中发现了第一个miRNA (Lee等人，1993 )，近年来已经发现，存在巨大数量的这种分子(高达2%的人基因组编码miRNAs (Miska， 2005))。最近，已经发现miRNAs对于发育(Ambros， 2003; Chen等人，2004)、细胞增殖和细胞死亡(Brennecke等人2003 )、细胞凋亡和脂肪代谢(Xu等人2003 )和细胞分化(Chang等人2004)而言是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术基于下述发现，即某些miRNA分子在哺乳动物生产细胞的生长周期的不同阶段表达不同。因此，本专利技术涉及哺乳动物生产细胞的修饰，以适当的现有方式增加或降低特定miRNA的水平(即如表l所示)，以调控细胞培养物的生长。在一个实施方案中，促进miRNA的表达，以促进细胞停滞。细胞停滞与细胞周期的G1 (生长停滞)期的细胞积累有关，且这与增加的生产率相关联。在一个不同的、但是有关的实施方案中，促进在培养初期的特定miRNA的抑制或阻抑，从而在生长停滞前促进生物量生成。这具有在更短的时间内产生增加的细胞工作原料的优点。在一个实施方案中，在开始时促进在培养初期的特定miRNA的抑制(或阻抑)，然后改变条件，以造成在细胞周期的生长停滞期中miRNA水平的增加(即通过miRNA的瞬时转染，或通过阻抑物的去除诱导编码miRNA的核酸的表达)。这些方法可以用于哺乳动物生产细胞培养物的生长和应用，尤其用于重组生物产品、特别是重组生物药物产品的生产。在本说明书中，术语哺乳动物生产细胞应当理解为是指，用于生产重组生物产品例如生物药品等的哺乳动物细胞。这样的细胞类型的实例是中囯仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。根据本专利技术，提供了，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，其包含下述步骤(a) 在细胞培养初期，制备一定生物量的哺乳动物生产细胞；和(b) —旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子水平的增加。本领域技术人员会知道何时达到希望的哺乳动物生产细胞浓度。 一般而言，这是在细胞周期的生长停滞期开始时或即将开始之前。通常，用一种或多种表1中的miRNA分子瞬时转染细胞。合适地，miRNA分子是miRNA前体分子，理想地合成的miRNA前体分子。不管怎样，miRNA分子可以是初始的miRNA或成熟的miRNA分子。表l中的初始的、前体和成熟的miRNA分子的序列可以在http:microma.sanger.ac.uk从miRNA序列、靶物和基因命名法数据库MIRBase得到。或者，可以用在转录启动子控制下的包含编码表1中的miRNA分子的核酸序列的表达载体瞬时转染细胞。通常，核酸序列编码表1中的miRNA分子的前体。合适地，转录启动子是组成型或诱导型启动子。理想地，启动子是温度诱导型的，当温度下降时理想地转换到两阶段细胞培养。利用该使用表达载体的瞬时转染方法，核酸序列也可以编码初始miRNA或成熟miRNA，但是通常载体编码表1中的任意miRNA分子的前体。表达载体可以是质粒、或线性核酸构建体例如PCR产物或限制片段。在本专利技术的一个实施方案中，使用基于脂质体的方法介导转染，例如，NeoFx (Ambion目录号:4511)。但是，技术人员会明白其它转染方法，例如，使用电穿孔介导的转染或使用磷酸钙介导的转染。作为瞬时转染的一个替代方案，该方法可以采用这样的细胞，其工程化成具有在诱导型启动子控制下且稳定整合到细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子的序列，且在这种情况下，该方法通常包含在生长周期中的希望的时刻诱导miRNA分子的表达，通常在细胞停滞期开始时或即将开始之前(即当已经达到希望的活生产细胞浓度时)。通常，启动子是温度诱导型启动子。在这种情况下，温度从37。C下降到31。C会诱导miRNA分子的表达。miRNA分子的编码序列可以编码miRNA的初始的、前体或成熟的形式；通常它编码miRNA分子的前体形式，该前体通过细胞体系加工成成熟的miRNA。在本专利技术的一个实施方案中，在生长初期使用合适的阻抑物抑制细胞中的miRNA编码序列，然后通过在生长停滞期时或即将开始之前撤去阻抑物，增加细胞中miRNA的水平。合适的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，该方法包含下述步骤：修饰哺乳动物生产细胞培养物，以调控细胞培养物中至少一种ｍｉＲＮＡ在生长周期中的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】IE 2006-8-4 S2006/05871、一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，该方法包含下述步骤修饰哺乳动物生产细胞培养物，以调控细胞培养物中至少一种miRNA在生长周期中的水平。2、 一种生产重组生物产品的方法，该方法釆用哺乳动物生产细胞培养物， 该方法包含下述步骤(a) 在细胞培养初期开始时或过程中，制备哺乳动物生产细胞的生物量；和(b) —旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一 种或多种表l中的miRNA分子水平的增加。3、 如权利要求1或2所述的方法，其中用一种或多种表1中的miRNA分子瞬时转染所述哺乳动物生产细胞。4、 如权利要求3所述的方法，其中所述miRNA分子是合成的miRNA前体分子。5、 如权利要求3或4所述的方法，其中使用脂质体递送、电穿孔或磷酸钙 介导所述转染。6、 如权利要求l或2所述的方法，其中用在转录启动子控制下的包含编码 表1中的miRNA分子的核酸序列的表达载体瞬时转染所述细胞。7、 如权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列编码表l中的miRNA分 子的前体。8、 如权利要求6或7所述的方法，其中所述转录启动子是组成型或诱导型 启动子。9、 如权利要求1或2所述的方法，其釆用工程化成具有在诱导型启动子控 制下稳定整合到细胞基因组中的表1中的miRNA分子的编码序列或其前体的 哺乳动物生产细胞，且其中该方法包含，在细胞周期的生长停滞期开始时或即 将开始之前，诱导miRNA分子的表达。10、 如权利要求9所述的方法，其中所述启动子是温度诱导型启动子。11、 如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述miRNA分子选自包含 hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。12、 如权利要求l所述的方法，其包含下述步骤在培养初期开始时或在 培养初期过程中，提高哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子 的抑制剂的水平。13、 如权利要求l所示的方法，其中所述至少一种miRNA是初始的、前 体、或成熟的表1中的miRNA。14、 如权利要求12所述的方法，其采用工程化成具有在诱导型启动子控制 下稳定整合到细胞基因组中的抑制剂编码序列的哺乳动物生产细胞，且其中该 方法包含，在培养初期开始时或在培养初期过程中，诱导抑制分子的表达。15、 如权利要求14所示的方法，其中表达由表达诱导物的存在或表达阻抑 物的缺失来诱导。16、 如权利要求14或15所述的方法，其中一旦达...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕克加梅尔，尼奥布鲁恩，马丁科莱尼斯，
申请(专利权)人：都柏林城市大学，
类型：发明
国别省市：IE[爱尔兰]