本发明专利技术描述了包含两个可溶ｇｐ１３０分子的多肽二聚体，其中所述分子每一个融合到ＩｇＧ１蛋白的Ｆｃ结构域，并且其中对所述Ｆｃ结构域的铰链区进行修饰，得到所述二聚体的有利性质。在特别优选的实施方案中，所述铰链区包含氨基酸序列基序Ａｌａ↓［２３４］－Ｇｌｕ↓［２３５］－Ｇｌｙ↓［２３６］－Ａｌａ↓［２３７］。此外，本发明专利技术描述了包含所述二聚体的药物组合物以及各种医学应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善的sgpl30Fc 二聚体本专利技术涉及一种多肽二聚体，所述多肽二聚体包含两个可溶的gpl30 分子，每一个gpl30分子融合到IgGl蛋白的Fc结构域，其中对所述Fc 结构域的铰链区进行修饰，导致所述二聚体的有利性质。本专利技术还涉及包 含所述二聚体的药物组合物和各种医学应用。多效细胞因子白细胞介素-6(IL-6)表现出广谱生物功能，其中在肝脏中 B细胞的刺激和急性期蛋白质合成的诱导通常是显著的。IL-6通过与IL-6 特异性表面受体(IL-6R)结合而在靶细胞上发挥其活性。这种受体/配体复 合物促进gpl30的同型二聚化，gpl30是IL-6受体复合物的第二亚基。 gpl30的二聚化导致IL-6信号的传导。当与IL-6复合时，通过两种机制(可 变剪接和释放)产生的可溶形式的IL-6R(sIL-6R)还能够引起gpl30的二聚 化和信号传导。由于IL-6R的细胞质部分不有助于信号转导，由gpl30同型二聚体导 致的信号传导可以由处于与结合的膜或可溶IL-6R的复合物中的IL-6所诱 导。然而，sIL-6R的存在导致IL-6反应细胞对所述配体的致敏。此外， 当存在于培养基中的sIL-6R被连续去除时，严格IL-6依赖型杂交瘤细胞 不响应于非常低量的il-6进行增殖。最初被描述为白细胞介素-6的信号转导物，gpl30是许多细胞因子如 IL-6、 IL-ll、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M(OSM)和睫状神经营养 因子(CNTF)共享的转导物链。所有这些细胞因子通过二-或三联受体复合 物作用，在所述复合物中信号传导由gpl30的同型二聚化(对于IL-6)或 gpl30与LIF-R (对于LIF， CT-1， OSM， CLC和CNTF)或OSM-R (对于OSM) 异型二聚化引发。因此，这些细胞因子可以在各种组织中介导相似的生物 活性。尽管可以在几乎所有细胞类型上发现gpl30，但是IL-6R表现出更加 局限得多的表达。一种细胞类型释放sIL-6R使得只表达gpl30的其它细胞 响应于IL-6。这种关系叫作反式信号传导。事实上，已经描述了一些需要sIL-6R和IL-6的复合物并且单独利用IL-6不能观察到的细胞活性。在人 血浆中发现高浓度的可溶的gpl30蛋白。最近已经描述了设计的细胞因子 超-IL-6(super-IL-6) (H-IL-6)，其中sIL-6R的C-端通过柔性的肽接头共价 融合到成熟IL-6的N-端。如利用复合物IL-6/sIL-6R可见，H-IL-6还在仅 表达gpl30的细胞上作用。与分离的成分IL-6和sIL-6R相反，100-1000 倍更低浓度的这种融合分子足以诱导相当的生物学信号。为了治疗各种疾病或病症，对依赖于可溶IL-6R的IL-6反应的特异性 阻断可能是需要的。这样的疾病包括骨吸收、高钙血症、恶病质、肿瘤或 其它类型的癌症(例如，结肠癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、霍奇 金病)、自体免疫病(例如，多发性硬化(MS)或1型糖尿病)、炎性或特异 反应性疾病(例如，局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、青 少年类风湿性关节炎、哮喘、银屑病、结节病、红斑狼疮或葡萄膜炎)、 感染(例如，细菌、病毒、真菌、或其它病原体感染)、以及内分泌疾病 和代谢作用或分解代谢疾病(例如，2型糖尿病、肥胖症、高血糖症或高 胆固醇血症)。发现例如sgpl30 二聚体或sgpl30Fc 二聚体对治疗应用是有 效的。本专利技术潜在的技术问题是提供改善的sgpl30Fc 二聚体。 所述技术问题的解决通过提供权利要求中表征的实施方案而实现。在 导致本专利技术的实验过程中，发现sgpl30Fc融合蛋白的生物活性、可纯化 性和稳定性显著地取决于sgpl30和Fc部分之间的铰链区的氨基酸组成。 将人IgGl-Fc的氨基酸234, 235和237 (按照EU编号)突变，以减少Fc 受体与该基序的结合(Duncan等，自然(Nature) (1988), 332: 563-564; Canfield和Morrison,实验医学杂志(J. Exp. Med.) (1991)， 173: 1483-1491; Wines等,免疫学杂志(J. Immunol.) (2000)， 164: 5313-5318; Sondermann 等，自然(Nature)(2000)， 406: 267)。出乎意料地，通过用谷氨酸(Glu, E)或 天冬氨酸(Asp,D)替换野生型序列Leu234-Leu235-Gly236-Gly237的Leu235，并 且由此用强亲水性(带电荷的)氨基酸破坏该疏水性基序，可能提高 sgpl30Fc融合蛋白的生物活性和稳定性。在位置234和237的突变增加这 种作用。最有效的突变体特征为序列Ala234-Glu235-Gly236-Ala237。附图简述图l: sgpl30Fc的铰链区突变蛋白人IgGl-Fc的下游铰链区(lower hinge region)通过位点定向诱变进行 修饰。理想的序列，如在本实验中确定，为"AEGA"(其结合在化合物 CR5/18中)0縮写和符号aa,氨基酸(s);^形成Fc融合蛋白的二聚化所需要的两 个二硫键的半胱氨酸；X，丙氨酸(Ala， A)或苯丙氨酸(Phe, F); Z,谷氨酸 (Glu，E)或天冬氨酸(Asp,D)。图2:野生型sgpl30Fc和CR5/18的大小排阻层析洗脱曲线与野生型sgpl30Fc相比，CR5/18表现出显著减少量的聚集物 (aggregate),并且因此显示更高产率的未污染产物。图3:由MTS细胞存活测定确定的CR5/18或野生型犯pl30Fc对 IL-6/sIL-6R-诱导的BAF3/gp130细胞的增殖的抑制在阻断由100 ng/mL IL-6和50 ng/mL sIL-6R引发的增殖中，CR5/18 比野生型(wt) sgpl30Fc生物活性显著更高。这由CR5/18的ICso(l)反映出 来，其约为sgpl30Fc的ICso(2)的一半。縮写和符号IC5。，具有50%抑制效率的浓度；IL-6,白细胞介素-6;I/R, IL-6加sIL-6R; MTS，被代谢活性细胞转化成在490 nm处吸收的可溶的甲 腊产物的底物；OD,在490 nm处的光密度；sIL-6R,可溶的白细胞介素-6 受体。因此，本专利技术涉及能够抑制激动复合物IL-6/sIL-6R的活性并且包含 两个单体的多肽-二聚体，其中每个单体包含与IgG蛋白的Fc结构域融合 的可溶的gpl30分子或其变体或片段，并且其中至少所述Fc结构域的铰链区的氨基酸残基LeU235被至少一个亲水性氨基酸残基替换。优选的亲水性氨基酸残基是Glu和Asp。当用于本文时，术语"可溶的"是指缺少细胞内结构域并且优选缺少 跨膜结构域的gpl30分子。本专利技术的二聚体可以使用已知方法加工。所用的结构域可以由gpl30 的完整的细胞外结构域组成，或者它们可以由其保留抑制激动复合物 IL-6/sIL-6R的活性能力的突变体或片段组成。优选的片段是至少由细胞外6结构域D1-D3组成的片段。表述"融合到IgG蛋白的Fc结构域"意指，优选地，所述二聚体的 融合配偶体仅由IgGl蛋白的Fc结构域组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽二聚体，其能够抑制激动复合物ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒ的活性并且包含两个单体，其中所述单体的每一个包含融合到ＩｇＧ１蛋白Ｆｃ结构域的可溶ｇｐ１３０分子或其变体或片段，并且其中至少所述Ｆｃ结构域铰链区的氨基酸残基Ｌｅｕ２３５被至少一个亲水性氨基酸残基替换。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：迪尔克泽格特，乔治H瓦茨格，
申请(专利权)人：康纳里斯研究院股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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