修饰的生长激素多肽制造技术

本文我们描述了修饰的生长激素融合蛋白和包含所述融合蛋白的二聚体；编码所述蛋白的核酸分子和使用所述蛋白治疗生长激素过量导致的状况的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的生长激素多肽本专利技术涉及修饰的生长激素融合蛋白和包含所述融合蛋白的二聚体；编码所述蛋 白的核酸分子和使用所述蛋白的治疗方法。生长激素(GH)是对于儿童期线性生长和成年正常机体组成来说重要的合成代谢 的细胞因子激素。GH活性的调节复杂且涉及许多相互作用的多肽和肽激动剂以及拮抗剂。 GH可通过结合生长激素受体直接介导其作用或通过刺激胰岛素样生长因子-1 (IGF-I)间 接介导其作用。因此，GH的主要作用是刺激肝脏产生IGF-I。另外，GH的分泌由两种具有 相反活性的肽激素控制。生长激素释放激素(GHRH)是一种由下丘脑弓状核产生的44氨基 酸肽。其功能是刺激脑垂体前叶产生GH。促生长素抑制素是一种对抗GHRH的作用的肽激 素，由较大的前多肽原加工成14和28氨基酸形式。促生长素抑制素由下丘脑的室旁核的 神经内分泌细胞分泌至与脑垂体前叶连接的下丘脑-垂直门脉系统中，在脑垂体前叶其抑 制GH的分泌。GH通过GH上被称为位点1和位点2的两个分离的位点顺序结合两种膜结合生长 激素受体(GHR)。位点1是高亲和力结合位点，位点2是低亲和力位点。单个的GH分子通 过位点1结合1GHR。然后通过位点2募集第二 GHR而形成GHR =GH =GHR复合体。然后，复 合体被内化并激活导致基因表达变化的信号转导级联。GHR的细胞外结构域作为两种连接 的结构域存在，各自约100个氨基酸(SD-100)，C末端SD-100结构域(b)与细胞表面最接 近，N末端SD-100结构域(a)与细胞表面最远。在三聚体复合体GHR-GH-GHR形成时，在激 素结合上发生这两个结构域的构象改变。GH过量与许多疾病状况有关，例如，肢端肥大症和垂体性巨大发育。大多数GH过 量的情况源于脑垂体前叶的生长激素细胞中的脑垂体肿瘤。这些肿瘤是良性的且逐渐增加 GH的分泌。生长激素过量的症状包括颂、指、趾的骨骼增厚，神经/肌肉压力以及胰岛素抵 抗。肿瘤相关的GH过量的最初治疗是手术去除脑垂体肿瘤。后来，使用GH拮抗剂抑制GH 信号传导由于其非侵入特性而变成优选治疗。GH拮抗剂可以是促生长素抑制素的重组形式 或促生长素抑制素类似物(例如，奥曲肽(octreotide)，兰瑞肽(lanreotide))或修饰的 GH。修饰的GH 拮抗剂的综述在 Kopchick (2003) European Journal ofEndocrinology(《欧洲内分泌学杂志》)148 ；S21-25中有提供，该文献描述了可商购获得 的称为培维索孟(pegvisomant)的GH拮抗剂，其将在G120修饰人GH与添加聚乙二醇结合 来增加修饰的GH的分子量。与生长激素给药有关的问题是其通过肾脏过滤和/或蛋白酶解 快速清除。添加聚乙二醇减少这种丧失。然而，已知聚乙二醇减小GH对于GHR的亲和力， 并因此为补偿该减小的亲和力，有必要进行高量修饰的GH的给药。这可导致副作用。提供 修饰的GH拮抗剂是合乎需要的，所述修饰的GH拮抗剂可以在减小的剂量下给药，由此避免 培维索孟相关问题。这可以是给药量减小或给药频率减小。在我们的共同未决的申请W003/070765中，我们描述了修饰的GH融合蛋白，其包 括对于GH中位点1和位点2的修饰。这些修饰的GH分子与GHR的细胞外结构域融合。在 这里，我们公开了修饰的GH融合蛋白，其具有大大延长的血清半衰期，并形成二聚体，这可能与通过减小肾清除率或保护修饰的GH免受蛋白酶解的这些融合蛋白的改进的药物代谢 动力学有关。这些生长激素融合蛋白的改进的药物代谢动力学模式(profiles)将允许不 需要多次给药且减轻不想要的副作用的治疗方案。根据本专利技术一方面，提供了核酸分子，其包含选自如下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 2所示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 4所示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 5所示的核酸序列；v) SEQ ID NO 7所示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 8所示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 10所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 11 所示的核酸序列；ix) SEQ ID NO 13所示的核酸序列；x) SEQ ID NO 14所示的核酸序列；xi) SEQ ID NO 16所示的核酸序列；xii) SEQ ID NO 17所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO 19 所示的核酸序列；xiv) SEQ ID NO 20所示的核酸序列；xv) SEQ ID NO 22所示的核酸序列；xvi) SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xvii)核酸分子，其包含在严谨杂交条件下与SEQ ID NO :1、2、4、5、7、8、10、11、13、 14、16、17、19、20、22或23杂交并编码具有生长激素受体拮抗剂活性的多肽的核酸序列。当两个互补的核酸分子相互之间经历一定量氢键合时，发生核酸分子的杂交。根 据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质以及所使用的核酸分子的组成和长度，杂交的 严谨性可不同。关于达到特定程度的严谨性所需要的杂交条件的计算在如下文献中讨 论Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆实验室手 册》(纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社，2001)；和Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes (生物 化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针杂交，第I部分，第二章)(纽约爱思唯尔， 1993)。Tm是50%的给定的核酸分子链与其互补链杂交的温度。下列是一系列示例的杂交 条件，不限于极高严谨性(允许共有至少90%同一性的序列杂交)杂交5XSSC，65°C，16小时洗涤两次2 X SSC,室温(RT)，各I5分钟洗涤两次0.5XSSC，65°C，各 20 分钟高严谨性(允许共有至少80%同一性的序列杂交)杂交:5X-6XSSC,65°C_70°C，16-20 小时洗涤两次2X SSC, RT,各5-20分钟洗涤两次1X SSC, 550C -70°C，各 30 分钟低戶謎(介Λ糊辟Φ 50%胃一性請歹丨丨棘)杂交6XSSC，RT-55°C,16-20 小时洗涤至少两次2X_3XSSC，RT_55°C，各20-30 分钟。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID NO 1所 示的核酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID NO :2所 示的核酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID NO 4所 示的核酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID N0:5所 示的核酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID N0:7所 示的核酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含或其组成为SEQ ID NO :8所 示的核酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸分子，其包含选自如下的核酸序列：　　ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核酸序列；　　ｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的核酸序列；　　ｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示的核酸序列；　　ｉｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５所示的核酸序列；　　ｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７所示的核酸序列；　　ｖｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８所示的核酸序列；　　ｖｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０所示的核酸序列；　　ｖｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１所示的核酸序列；　　ｉｘ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３所示的核酸序列；ｘ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４所示的核酸序列；　　ｘｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６所示的核酸序列；　　ｘｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７所示的核酸序列；　　ｘｉｉｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９所示的核酸序列；　　ｘｉｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０所示的核酸序列；　　ｘｖ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２所示的核酸序列；　　ｘｖｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３所示的核酸序列；　　ｘｖｉｉ）包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列在严谨杂交条件下与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２或２３杂交并编码具有生长激素受体拮抗剂活性的多肽。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得阿蒂米克，理查德A罗斯，乔恩塞耶斯，
申请(专利权)人：埃斯特瑞恩有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]