用作葡萄霜霉菌拮抗剂物质的包含内生真菌互隔交链孢霉菌和/或其代谢物的抗真菌组合物制造技术

本发明专利技术涉及含有真菌互隔交链孢霉菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ａｌｔｅｒｎａｔａ）和／或属于二酮哌嗪（ＤＫＰ）家族的式（１）、式（２）和式（３）的其次生代谢物的组合物，用于控制病原体真菌葡萄霜霉菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ　ｖｉｔｉｃｏｌａ）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含真菌互隔交链孢霉菌(J/rAmnVi 和/或属 于二酮艰溱(DKP)家族的其代谢物的组合物，用于控制病原体真菌葡萄 霜霉菌(户/fls附印flm v/ft'co/fl)，其为葡萄霜霉病的药剂。主要的三种代谢 物分别是具有以下各式的下述化合物环(L-苯丙氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(1)环(L-亮氨酸-反式-4-羟基-L-脯氨酸)(2)环(L-丙氨酸-反式斗羟基-L-脯氨酸)(3)
技术介绍
所有品种的葡萄(v/rtiy^rfl)都易感染霜霉病，这种病是由病原 体葡萄霜霉菌引起的。相反地，来自其中寄生虫的存在对地方种群的选 择发挥强大作用的潮湿地区的美洲葡萄(F 's fl附w/owm)品种则具有 抵抗力0直到50年代，化学性对抗葡萄霜霉病几乎完全基于使用涂覆rameic 产品波尔多混合剂(Bordeaux mixture)和氧氯化铜，所述产品除了强 的抗霜霉病活性以外，还具有不可忽略的抗粉孢子(Oidium)和葡萄孢属(Botritis)的活性。二价铜产品已经被几种有机合成产品(氨基甲酸 酯类、邻苯二甲酸类似物(phthalymmidic)等)部分替代。直到如今， 还主要采取以下两种策略来减少由所述病原体引起的损伤持续涂覆和 导引性对抗(guided struggle )。所提议的解决办法可能不够适当，尤其是在持续降雨时期，这时一 旦发生感染，必须通过使用可一次性施用的系统性杀真菌剂进行紧急处 理。然而，这样介入的风险在于可能产生真菌的耐药林。而且，根据当前对于涂覆非二价铜产品进行的研究，已突出表明尽 管它们与铜不同不对葡萄产生危害植物的毒性，但它们可能对人有毒。 事实上，已发现在种植葡萄和制造葡萄酒的工人中，ETU(亚乙基硫脲， 代森锰锌(Mancozeb )的降解产物)的平均痕量是可在其余人群中发现 的平均痕量的4倍。应当提醒，亚乙基硫脲被认为是一种潜在的致癌物 质，从这一点本身来讲，足以解释寻找替代方法的原因。考虑到仅基于植物药物介入(phytoiatric intervention )的对抗策略 容易产生各种缺点，因此探寻了将具有部分单一功效的不同和互补的对 抗方法进行协同联合。这样的方法通常称为综合性对抗方法，其基本上 基于联合使用低剂量抗真菌剂和病原体拮抗剂。然而，它们并不具有完 全功效。由Raziq和Fox ( 2002 )进行的研究是综合性对抗cryptogram 病的一个具体实例，其中利用拮抗剂和抗真菌剂对苹果植株上的蜜环菌 (^7W///tf/7Vl/lie//e)进行综合控制。在葡萄霜霉菌的具体情况下，目前 还没有综合方法被授予专利权。在葡萄的生物栽培中，迄今为止对抗葡萄霜霉病的方法主要是基于 使用天然物质尤其是铜。然而，由于其在土壤中积累可能对环境产生负 面的后效应，其使用存在争议。由于这一原因，自2002年开始，二价 铜化合物在生物农业领域中的使用已经受到具体法规的限制，目的在于 规定可应用的金属铜的最大值。一种用于防护该病原体的真正可替代方法是使用拮抗剂生物。所述 拮抗剂(或生物控制剂)是一种天然存在的生物，其可限制该病原体的 生长并使其保持在经济损失的阈值以下；所述拮抗剂并不完全消除病原 体，但其限制病原体的生长并因此减少对作物的损害。在文献中，有应用拮抗剂控制由病原体生物引起的不同植物品种的一些疾病的实例，并且其中一些涉及葡萄霜霉病(Falk et al., 1996; Kortekamp， 1997 )。然而，对于葡萄而言，还没有关于^吏用内生真菌(尤 其是互隔交链孢霉菌)作为拮抗剂生物以及由其产生的代谢物的应用的报 道.内生菌是其部分或整个生物周期都在宿主植物体内度过但不引起可 见的疾病症状的微生物(真菌、细菌和放线菌)。那么，所述内生真菌 就是无症状的，其与植物的关系可解释为共生型的相互作用(Clay, 1991)。内生菌能够合成多种可广泛用于医药、医药工业和农业中的次 生代谢物(Gusman e Vanhaelen， 2000 )。
技术实现思路
现已出乎意料地发现，葡萄的内生真菌互隔交链孢霉菌和/或其某些 次生代谢物可用作葡萄霜霉菌的拮抗剂。有利地，其用途以组合物的形式 实现，所述组合物包含上述拮抗剂和通常用于待用于植物的抗真菌组合物 中的赋形剂与添加剂。因此，本专利技术的一个目的是抗真菌组合物，其包含作为葡萄霜霉菌 拮抗剂的各种形式的互隔交链孢霉菌真菌以及适用于农业中所用的抗真 菌组合物中的赋形剂和添加剂。有利地，使用活跃生长中的互隔交链孢霉 菌的菌丝体。本专利技术的另一个目的是由互隔交链孢霉菌制备葡萄霜霉菌拮抗剂提取 物的方法，其包括以下步骤a. 将互隔交链孢霉菌的生长中的菌丝体部分接种到培养用肉汤中， 并且可能地进行搅拌，孵育12-60小时，冷冻并冻干；b. 将由步骤a)得到的冻干肉汤溶于水中，过滤并用中等极性的溶 剂(优选正丁醇)萃取水溶液，直到得到有机相；c. 通过制备性色镨在硅胶层上利用重量比为60:15:25的正丁醇/ 乙酸/水的混合物进行洗脱而将所述有机相进行分级分离，直到 得到三个级分A、 B和C;d.通过薄层色镨，利用重量比为9:1的二氯甲烷/甲醇的混合物进 行洗脱，将级分A和B继续分级分离，直到得到下式(l)(Rf 0.48)和(2)(Rf0.43)的化合物还可针对上述方法增加额外的步骤e)(仍构成本专利技术的主题)，在该 步骤中将所述级分C进行薄层色谱处理，利用重量比为85:15的二氯甲 烷/甲醇的混合物进行洗脱，直到得到下述式(3)(Rf0.40)的化合物根据本专利技术，可制备葡萄霜霉菌的拮抗剂组合物，其包含所述三种级 分A、 B和/或C中的一种或多种，和/或所述化合物(1)、 (2)和/或(3) 中的一种或多种，以及常用于农业中所用的抗真菌组合物中的添加剂和/ 或赋形剂。已知互隔交链孢霉菌在几种草本和乔木树种中作为内生真菌；迄今为 止对其在葡萄中所知甚少(Cardinali et al., 1994)，但还没有关于通过 葡萄内生菌互隔交链孢霉菌制备二酮嗛嚷(DKP)的报道。互隔交链孢霉菌的次生代谢物是已知的属于二酮艰唤(DKP)化学物 质家族中的化合物，本专利技术提出了其用途。所述二酮哌溱是可见于自然界(动物界和植物界)中的小肽衍生物。 其化学构型简单，对蛋白水解稳定，其合成路线众所周知，因此，其可7在实验室中容易地合成(Horton et al.， 2000 )。在医药领域中，它们用作抗生素、合成疫苗、化疗产品和抗高血压 药；在农业中，已经利用它们对抗非生物胁迫(abiotic stress)和作为 抗菌物质和抗真菌物质(Horton et al 2000; McCleland et al ， 2004 )， 但还从来没有被报道过用于抗葡萄病原体，尤其是抗葡萄霜霉菌。就有关抗病原体真菌(其中包括葡萄霜霉菌)的其它活性二肽分子 的才艮道而言，可引用Camaggi等的美国专利6,084,065和Filippini等 的美国专利6,448,228。上述专利公开了用于制备具有抗微生物作用和杀 虫作用的肽分子的新合成方法。使用真菌对抗葡萄霜霉菌的优点如下该内生真菌既不引起症状，也 不导致葡萄的其它变化，但其能够通过破环孢子形本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗真菌组合物，其包含作为葡萄霜霉菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ　ｖｉｔｉｃｏｌａ）拮抗剂物质的各种形式的真菌互隔交链孢霉菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ａｌｔｅｒｎａｔａ）以及适用于农业中所用的抗真菌组合物中的赋形剂和添加剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】IT 2006-6-16 RM2006A0003151. 抗真菌组合物，其包含作为葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)拮抗剂物质的各种形式的真菌互隔交链孢霉菌(Alternaria alternata)以及适用于农业中所用的抗真菌组合物中的赋形剂和添加剂。2. —种用于由互隔交链孢霉菌制备葡萄霜霉菌拮抗剂提取物的方 法，其包括以下步骤a. 将互隔交链孢霉菌的生长中的菌丝体部分接种到培养用肉汤中， 并且可能地还进行搅拌，孵育12-60小时，冷冻并冻干；b. 将由步骤a)得到的冻干肉汤溶于水中，过滤并用中等极性的 溶剂、优选正丁醇萃取所述水溶液，直到得到有机相；c. 通过制备性色镨在硅胶层上利用重量比为60:15:25的正丁醇/ 乙酸/水的混合物进行洗脱而将所述有机相进行分级分离，直到得 到三个级分A、 B和C;d. 通过薄层色镨，利用重量比为9:1的二氯甲烷/甲醇的混合物 进行洗脱，将级分A和B继续分级，直到得到Rf值为0.48的下 述式(1)化合物和Rf值为0.43的下述式(2 )化合物<formula>formula see original document page 2</formula&g...

【专利技术属性】
技术研发人员：丽塔穆塞蒂，米凯莱德安布罗西奥，斯特凡诺博尔塞利，
申请(专利权)人：乌迪内大学，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]