一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料及其制备方法。将新鲜猪肩胛骨处的松质骨，清洗后分切成直径５ｍｍ～１０ｍｍ、厚度３ｍｍ～５ｍｍ的小块，经脱脂、脱钙、脱蛋白处理后，再以酒精浸泡３０分钟，风干后得到。其中，脱钙时间为６小时。制备得到的脱钙松质骨基质（ＤＳＢＭ）具有制备方法相对简便，并可大量获取的特点，低温下能长期保存，经济廉价。可按修复缺损的形状制成不同的形状和大小，应用方便。ＤＳＢＭ既保留了猪松质骨的天然网状空隙结构系统，又具有良好的细胞和生物相容性、可降解性，是一种很好的软骨组织工程支架材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于软骨缺损修复材料
，具体涉及一种用于软骨缺损修复的组织 工程支架材料。同时本专利技术还涉及该支架材料的制备方法。
技术介绍
由创伤和退变所致关节软骨缺损在临床上十分常见，关节软骨损伤后，自身修复 能力有限，如何修复关节软骨和软骨下骨的损伤、促进关节软骨自身修复、重建关节功能成 为临床医师和研究人员需要解决的重要问题。关节研磨成形术、软骨下钻孔或微骨折术等通过将血液和骨髓中的各种祖细胞迁 移至关节软骨缺损区，产生纤维软骨修复。虽然纤维软骨在结构和功能上与透明软骨均有 很大差别，但这种治疗方法可有效地缓解患者疼痛，改善关节功能，仍是目前临床治疗局限 性软骨缺损的一线治疗方法。骨膜、软骨膜、骨软骨移植是临床上治疗软骨缺损的另一种 选择，虽然它可以产生一定程度的透明软骨，改善患者关节功能，但仍然缺乏长期疗效的 临床证据，而且由于供体有限，常常限制了其临床应用。自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte transplantation, ACT)可以产生一定程度的透明软骨，是近年来应用于临床 的一种治疗方法，欧美已有大量的患者接受此种治疗，短期临床研究报告显示其有较好的 疗效，但仍然存在细胞分布不均、易漏出、软骨退变、层离、纤维化导致移植失败等问题。为 了解决这些问题，很多学者进行了以细胞和三维支架材料为基础的组织工程方法修复软骨 缺损的实验研究，并取得良好的结果。在以组织工程方法修复软骨缺损的过程中，修复组织和正常组织的整合尤为重 要，其与多种因素相关，包括软骨缺损的类型、软骨的形成和移植材料的降解等，而支架材 料的选择是影响修复质量的一个重要因素，用于组织工程软骨的支架材料主要分为人工合 成材料(如PLA、PGA、PLGA等)和生物衍生支架材料(如透明质酸、胶原、藻酸、壳聚糖及脱 细胞基质等)。生物衍生支架材料不仅具有良好的生物相容性及良好的生物降解性，而且含 有可以促进种子细胞粘附、增殖及分化的生物活性分子，具有人工合成支架材料无可比拟 的优势。脱钙骨基质(Demineralized bone matrix, DBM)是生物衍生支架材料中的一种， 其主要是利用同种或异种器官/组织，经过脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。该 材料具有细胞外基质成分，有良好的组织亲和性和相容性，有利于细胞的黏附、增殖和分 化，并且具有一定的力学强度，DBM具有三维天然孔隙结构系统，同时含有I型胶原，胶原是 细胞黏附和生长的良好支架，以其作为支架材料，它具有可降解性，易于被机体吸收，因而 脱钙骨基质(DBM)不仅具有良好的生物相容性和生物降解性，而且具有天然孔隙结构，有 利于细胞长入，含有可以促进种子细胞粘附、增殖及分化的生物活性分子，具有人工合成支 架材料无可比拟的优势。Kasten等对人工合成的羟基磷灰石(CDHA)、磷酸三钙及脱钙骨基 质(DBM)从种子细胞的粘附率、长入支架内部的数量、增殖和分化效率等方面作过比较，结 果证明DBM为三者中最优。van Osch等研究发现脱钙骨基质(DBM)复合软骨膜在兔动物模型上具有可靠的成软骨能力。Zhou等发现脱钙骨基质粉(DBP)可以诱导体外三维培养的入 骨髓基质干细胞(hMSCs)向软骨细胞分化。Gao等将DBM和骨髓基质干细胞(BMSCs)复合 培养后修复兔膝关节负重区软骨缺损，结果软骨缺损深度的95%得到修复。但现有技术中 由于DBM的脱钙强度和时间各异，导致修复骨与软骨的作用不一致。本申请的专利技术人研究 后发现，适量脱钙后的骨基质有利于软骨形成、而过量的脱钙骨基质其成软骨能力降低，部 分原因可能是适量的脱钙可以使骨基质中含有的骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-i3等生物活 性因子成分暴露，而过量的脱钙则影响了脱钙骨基质的活性，而使脱钙骨基质修复软骨的 能力受到影响。此外，国内外目前主要采用牛骨、兔骨、羊骨等作原材料，而这些异种骨材料 结构与人相差甚远，而同种异体人骨材料来源有限，且易传播肝炎、爱滋病等。如何克服上 述不足，让脱钙骨基质这种新型支架材料更好地为患者服务，就成为现有技术中亟待解决 的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于软骨缺损修复、具有良好 生物相容性、降解性和生物活性的组织工程支架材料。本专利技术的目的还在于提供一种制备所述组织工程支架材料的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现。一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料，其特征在于将新鲜猪肩胛骨处的 松质骨，清洗后分切成直径5mm 10mm、厚度3mm 5mm的小块，经脱脂、脱钙、脱蛋白处理 后，再以酒精浸泡30分钟，风干后得到；其中，脱钙时间为6小时。制备该组织工程支架材料的方法，包括以下步骤1、制备骨块以新鲜猪肩胛骨为原料，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨，反复 流水搅拌冲洗，清除骨髓、血污及表面油脂，分切成直径5mm 10mm，厚度3mm 5mm的小 块，清水冲洗干净；2、将洗净的骨块置于体积分数1 1的氯仿甲醇混合液中，室温浸泡脱脂2次，每 次6小时，然后风干；3、风干后的骨块置于浓度为0. 6mol/L的盐酸水溶液中室温浸泡脱钙6h，盐酸水 溶液与骨块的体积重量比为20mL/g，脱钙完成后，再将骨块置于浓度重量百分数0. 的、 PH值7. 4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡12 24小时，风干；4、骨块再用体积分数1 1的氯仿乙醇混合液浸泡脱脂6小时，风干；5、风干后的骨块以蒸馏水反复漂洗直至pH值7. 0 ；6、将骨块置于浓度重量百分数0. 的、pH值7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，恒温37°C 浸泡72小时，风干；7、最后将风干的骨块置于浓度重量百分数75%的酒精中浸泡30分钟，再次风干 后即得到所需的用于软骨缺损修复的组织工程支架材料。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果1、本专利技术的脱钙松质骨基质(DSBM)具有制备方法相对简便，并可大量获取的特 点，低温下能长期保存，经济廉价；可按修复缺损的形状制成不同的形状和大小，应用方便； DSBM既保留了猪松质骨的天然网状空隙结构系统，又具有良好的细胞和生物相容性、可降4解性，是一种很好的软骨组织工程支架材料。2、根据我国国情，选用来源广、适宜移植的猪松质骨为原材料，而国外多采用牛骨 为原材料。由于猪的解剖生理与人类相近，猪与人MHC-DR基因在同源性高的区域有约60% 的相同性，是器官移植供体动物中较能接受的对象，研究发现，新鲜猪骨和正常人骨的无机 成份含量比较接近，因此采用猪骨为原材料进行理化加工处理，更易制备出类似人体骨组 织天然结构和性能的材料。3、猪松质骨在经过脱脂、脱钙、脱蛋白等一系列理化处理后，其主要成分是胶原纤 维，外观为多孔的海绵样结构，孔隙相互交通，可提供宽大的内表面积和空间，还含有BMP 等多种生物活性物质，有利于种子细胞的黏附、增殖和分化、生长的空间，有细胞外基质的 分泌，气体和养分的交换，同时具有良好的生物相容性。4、该产品具有极低的免疫原性，动物实验证实，DSBM移植后免疫排斥反应低，并且 具有较强的诱导骨、软骨生长、分化的作用，DSBM具有良好的细胞及组织相容性的同时，还 具有消毒后保持其软骨诱导能力的特性，其保存了具有诱导成软骨能力的骨形态形成蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料，其特征在于：将新鲜猪肩胛骨处的松质骨，清洗后分切成直径５ｍｍ～１０ｍｍ、厚度３ｍｍ～５ｍｍ的小块，经脱脂、脱钙、脱蛋白处理后，再以酒精浸泡３０分钟，风干后得到；其中，脱钙时间为６小时。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦林，刘流，韩睿，王福科，金耀峰，陈建明，
申请(专利权)人：昆明医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：53[]