一种ＧＦＰ膜型表达的载体及转染该载体的阳性细胞的分选方法技术

本发明专利技术公开了一种ＧＦＰ膜型表达的载体及转染该载体的阳性细胞的分选方法，所述的ＧＦＰ膜型表达的载体，包括多克隆位点，多克隆位点之后依次连接有核糖体进入位点和编码绿色荧光蛋白的序列，构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子；在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入编码信号肽的序列，在编码绿色荧光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列。克隆入目的基因的ＧＦＰ膜型表达载体转染细胞成功之后，会在细胞表面形成独特的筛选标签——膜型ＧＦＰ，而没有转染成功的则不会形成。利益磁场分选结合磁珠的阳性细胞，简化了筛选步骤，可以快速有效富集阳性细胞，是一种可以高效分选出转染阳性细胞的技术手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及外源目的基因表达阳性细胞的筛选，特别涉及一种GFP(绿色荧光蛋白)膜型表达作为分选标记的真核表达载体，以及利用该载体的进行转染细胞分选的方法。
技术介绍
在现代生物技术中，利用质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞，在宿主细胞中扩增、转录、翻译从而使外源基因高效表达是一项非常重要的技术；不管是通过外源基因的导入改变宿主细胞原有的生物学行为，还是利用宿主细胞表达具有生物学活性的外源蛋白都有着十分广泛的应用。但该项技术有一个关键的瓶颈，就是转染效率不高的问题。一般而言，随细胞系和转染试剂的不同，转染效率也各不相同，但总体都偏低。由于转染效率的低下，目的基因转染宿主细胞后，不表达外源基因的野生型宿主细胞仍然占大部分；这样的异质性细胞群体对于需要研究的特定细胞而言，大大影响了实验结果的科学性。因而，在基因转染操作完成后，如何从数量巨大的细胞群中检测并分选出为数极少的目的基因转染阳性的细胞、提高转染效率，就成为建立真核细胞表达系统的一个关键。目前筛选转染阳性细胞常用的方法是在真核表达载体中加入一段药物抗性基因， 通过在细胞培养体系中加入相应的细胞毒性药物产生选择压力进行筛选，例如普遍应用的新霉素抗性基因(neor)。其原理在于氨基糖苷类抗生素新霉素及其类似物G418可以通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成从而杀死野生型细胞。真核表达载体上携带的neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，其蛋白产物能够分解新霉素和G418，可以使转染了目的载体的阳性细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。与此原理类似的还有^ocin 抗性选择、Hygromycine抗性选择、Puromycine抗性选择等。上述的药物抗性基因筛选技术虽然可以有效的去除未导入质粒的野生型细胞，扩大了基因转染技术的应用范围，但仍存在不足之处。具体说来，对于瞬时转染而言，尽管抗性基因的表达和目的基因的表达是同步的，但在瞬时表达的较短时间(数天)内，细胞毒性的抗生素还不能够有效的杀死野生型细胞，转染后的异质性细胞群仍不能满足大多数实验的要求；进行抗性筛选往往是要获得可以长期表达目的基因的稳定细胞株，这时由于质粒的抗性基因与目的基因分别属于不同启动子控制下的两个转录本，其整合到宿主细胞基因组的过程是随机的，因而两个基因不一定同时整合到基因组，即使整合到同一个细胞的基因组中，由于基因插入的位置影响，两个基因并不一定同时表达，因此通过抗性基因选择压力的方法对转染细胞进行筛选时，最终所获得的转染细胞其实是抗性基因稳定表达的细胞，而研究者所关心的目的基因表达水平却成为随机数。而且，随着培养时间的延长和细胞传代次数的增加，同时表达抗性基因和目的基因的细胞负荷较只表达抗性基因的细胞负荷要大一些，在细胞群中占的比例将进一步下降(除外目的基因可以促进细胞增殖的个别特殊情况)。这种方案既耗时效率又低，要分选出表达了目的基因的细胞株通常需耗费一个甚至几个月的时间，而最终获得的细胞株很有可能仍然是异质性细胞群。所以，为了解决如何获得高纯度表达外源基因的宿主细胞的问题，除了开发新的转染试剂提高转染效率外，近年来有越来越多的技术应用于如何分选转染了目的基因的阳性细胞。利用转染细胞所获得的某些特性，比如转染细胞表达特异性染色或荧光蛋白，通过流式细胞仪来进行分选。绿色荧光蛋白(GFP)来源于维多利亚多管发光水母，经基因工程改造后的突变型 GFP蛋白在488nm激光照射下会发出绿色荧光，其发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域。GFP作为一种筛选标记，在现有商品化的真核表达载体中一般位于两处，一是在多克隆位点(MCS)处，目的基因插入MCS后与GFP形成融合表达，即成熟蛋白的N端或C端带有GFP 标签；第二种情况是GFP位于核糖体进入位点(IRES)后，转录成双顺反子，GFP游离表达于细胞质内部。一般而言，GFP作为筛选标记可以通过流式细胞术分选出转染阳性的细胞群， 但是普通的流式细胞仪不能进行分选操作，流式分选依赖于昂贵的大型专业仪器设备(如 BD公司的FACS Aria型)，所需费用较高且对细胞有一定的损伤，使其推广应用受到限制。近年来，利用细胞表面的特定蛋白分子，通过抗原抗体特异性结合反应来分选某种类型细胞的方法在生命科学研究和临床实践中有着越来越广泛的应用。例如军事医学科学研究院裴雪涛等人的专利技术“含有CD34标志基因用于转染细胞分选的载体的构建及其应用”(公开号CN1712535A)。利用⑶34分子作为筛选标志，可以分选出同时表达目的基因和 CD34分子的转染阳性细胞，但该方案仍然存在影响其广泛应用的弊端CD34分子是哺乳动物细胞的天然蛋白，表达于多种细胞表面，如造血干/祖细胞，以CD34作为标签蛋白分子， 其应用范围就受到局限。CD34分子可以与CD62L分子发生特异性相互作用，转染细胞异位表达CD34会对部分细胞学实验造成干扰。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于提供一种GFP膜型表达的载体，以及转染该载体的阳性细胞的分选方法，克服上述转染效率低、耐药细胞假阳性高、分选技术存在局限的缺陷， 简化传统转染细胞筛选过程，提高转染细胞的分选效率。本专利技术通过以下技术方案实现一种GFP膜型表达的载体，包括多克隆位点，多克隆位点之后依次连接有核糖体进入位点和编码绿色荧光蛋白的序列，构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子； 在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入编码信号肽的序列，在编码绿色荧光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列。所述的信号肽的序列如SEQ. ID. NO. 1所示；所述的疏水性跨膜区序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。所述的编码信号肽的序列如SEQ. ID. NO. 3所示；所述的编码疏水性跨膜区的序列如 SEQ. ID. NO. 4 所示。GFP膜型表达载体转染细胞后的阳性转染细胞的分选方法，，包括以下步骤1)在GFP膜型表达载体的多克隆位点插入外源目的基因，构成外源目的基因与绿色荧光蛋白的转录双顺反子；然后在GFP膜型表达载体转染宿主细胞后，收集待分离的细胞制成单细胞悬浮液；2)将抗GFP单克隆抗体与二抗磁珠混合均勻，使抗GFP单克隆抗体结合到二抗磁珠的表面；3)在制成的单细胞悬浮液加入结合了抗GFP单克隆抗体的二抗磁珠，充分混勻， 使结合了抗GFP单克隆抗体的二抗磁珠与GFP膜型表达的阳性转染的细胞结合；4)在磁场作用下，将结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞与未结合二抗磁珠的细胞分离；收集结合了二抗磁珠的阳性转染的细胞，并将磁珠与阳性转染的细胞分离，得到纯化的阳性转染的细胞。所述的二抗磁珠是磁珠通过连接DNA与能够识别抗GFP单克隆抗体的抗体相连接。所述的抗GFP单克隆抗体为鼠源性抗体，二抗磁珠是磁珠通过连接DNA与人抗小鼠的单抗连接。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、本专利技术提供的GFP膜型表达的载体，绿色荧光蛋白表达后在信号肽的引导下穿出细胞膜，并在疏水性跨膜区的作用下固着于细胞膜表面，成为阳性转染细胞新的筛选标签——膜型GFP(mGFP)；而同时由于目的基因插入多克隆位点之后将会与绿色荧光蛋白基因形成转录双顺反子，实现目的基因和膜型GFP的共表达，这样膜型GFP就成为了目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＧＦＰ膜型表达的载体，其特征在于，包括多克隆位点，多克隆位点之后依次连接有核糖体进入位点和编码绿色荧光蛋白的序列，构成多克隆位点与绿色荧光蛋白的转录双顺反子；在核糖体进入位点与编码绿色荧光蛋白的序列之间插入编码信号肽的序列，在编码绿色荧光蛋白的序列终止密码子之前加入编码疏水性跨膜区的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庄然，张圆，金伯泉，李琦，张宇丝，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]