一种哺乳类动物生雌性控方法技术

本发明专利技术属于哺乳类动物性别比例控制技术领域，特别涉及在雌性哺乳类动物体内杀死雄性胚胎的方法。其特点是把Ｈ－Ｙ单克隆抗体和补体输入怀孕动物的子宫角，在怀孕动物体内杀死雄性胚胎。试验表明，用该方法可以使后代雌性的百分率达８４％以上。本方法操作简便、安全可靠，适用于各种哺乳类动物特别是家畜的雌性扩繁生产。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于哺乳类动物性别比例控制
，特别涉及在雌性哺乳类动物体内杀死雄性胚胎的方法。在公知技术中，与本专利技术较为相关的技术是利用含有H-Y抗体的抗血清在动物体外鉴别胚胎的性别。在这方面，南朝鲜的Im等人(Anim.Biotech.Bull.34-37，1991)，国内许晓霁等人(东北农学院学报，2∶186-191，1990)近年来都曾用含有H-Y抗体的抗血清鉴定过小鼠和兔子胚胎的性别，其准确率达80%左右。但由于这种方法需要先将胚胚移到动物体外，经鉴定性别后，再移回动物体内，所以不仅技术复杂，操作麻烦，同时还降低了胚胎的活力，使其成活率下降，致使这种方法难以在生产中推广应用。本专利技术的目的在于提供一种在哺乳类动物体内能有效地杀死雄性胚胎并使之多生雌性后代的方法。本专利技术所依据的理论是免疫学原理，即在雄性胚胎中存在有H-Y抗原，可与H-Y抗体发生反应，如有补体存在，则可介导补体参与反应，从而导致雄性胚胎溶解死亡。本专利技术的技术解决方案可以包括下述两个方面1、在雌性动物受精后3-5天，胚胎发育至8细胞期至早期囊胚阶段时，把H-Y单克隆抗体与补体同时输入怀孕动物的子宫角，在怀孕动物体内杀死雄性胚胎。2、一种用于在怀孕动物体内杀死雄性胚胎的H-Y单克隆抗体的制备方法，包括(1)用G57BL/6纯系小鼠制取脾细胞;(2)筛选并准备SP2/0骨髓瘤细胞;(3)饲养细胞;(4)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合;(5)筛选含有杂交瘤的阳性孔及克隆;(6)收集H-Y单克隆抗体;(6.1)血清DMEM培养上清液;(6.2)无血清DMEM培养上清液;(6.3)给C57BL/6雌性小鼠接种;(7)对杂交瘤细胞及H-Y单克隆抗体进行鉴定，其主要特点是(1.1)将雄性小鼠脾细胞注射给雌性小鼠的时间为连续56-91天，每7天注射一次，于第42-77天时进行眼眶采血，检测血清抗体效价;(5.1)用生物素化第二抗体和酶标记亲合素代替常规ELISA的酶标记第二抗体，用含有BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸盐缓冲液)作为冲洗液冲洗ELISA反应板;(5.1.1)BSA的浓度为0.1%。本专利技术具有以下积极效果1.本专利技术为哺乳类动物特别是家畜生雌性控技术的应用提供了一条新的途径。通过对30只小鼠和10只家兔的试验，在获得的100多只后代中，雌性后代的百分率平均为84%以上。2、使用本专利技术无论多胎动物还是单胎动物均可多生雌性。在多胎动物中，如绵羊、山羊，用PMSG(孕马血清促性腺激素)和HCG(人绒毛膜促进腺激素)使动物多排卵，然后再应用H-Y单克隆抗体。这样在杀死雄性胚胎之后，所剩雌性胚胎的数目比自然排卵的总数还多，因此，在使动物多生雌性后代的同时，后代总数也有所增加。在单胎动物中，如奶牛，如果怀孕雌性胚胎，则在应用H-Y单克隆抗体之后，对其无任何不良影响;若怀孕雌性胚胎，则将其杀死。待过一个发情周期后，再行配种，其结果使奶牛多生雌性后代。3、成本低。据计算，利用本专利技术使家兔、绵羊、奶牛每生一只(头)雌性后代的花费仅分别为0.5元、5元和10元人民币，而产生的经济效益则比自然生产提高一倍至几十倍。4、方法简便，容易操作，便于推广。应用本专利技术时，只需把H-Y单克隆抗体输入子宫，故一般同行技术人员都可以熟练掌握操作。对H-Y单克隆抗体，只要具备所需的实验室条件，按本专利技术的方法，步骤便可制取。下面结合实施例对本专利技术作进一步阐述实施例1应用H-Y单克隆抗体可使小鼠多生雌性后代。具体做法是分别挑选30只2月龄雌性和20只3月龄体大，健康的雄性普通昆明小鼠(北京医科大学实验动物部提供)，雌鼠分10个笼子饲养，公鼠则一个笼子饲养一只，自由采食颗粒饲料和饮水。试验期间白天开日光灯增强光照，晚间关灯。试验开始时，先对雌性小鼠进行超数排卵处理。超排处理的第一天，每只小鼠腹腔注射PMSG(卫生部长春生物制品厂生产)3单位，第三天同法注入HCG(上海生物制品厂生产)3单位。第三天傍晚把按上述方法处理过的小鼠与公鼠合笼。次日检查阴道栓，并作记录。见栓后的第3天和第4天腹腔注入0.05毫升戊巴比妥钠(33mg/ml)，随后将一外径为0.1-0.2毫米的塑料软管通过阴道插入子宫，并通过该导管输入单克隆抗体及补体各0.5毫升，提起后腿约1分钟，放回笼内饲养。21天后生产。在小鼠生长至半月龄后可检查雌雄比例。结果表明，后代中雌性占85%。实施例2应用H-Y单克隆抗体可使家兔多生雌性后代。具体做法是挑选10只4月龄健康母兔和5只6月龄公兔，单兔单笼饲养，自由采食配合饲料和饮水。试验开始时，先对母兔给予超排处理。超排处理的第一天背部皮下注射PMSG 100单位，第3天同法射HCG80单位后，放入公兔交配。于交配后第3天和第4天，由一人固定母兔，一人将一外径为0.5毫米的橡胶导管通过阴道，插入子宫约3厘米，并通过该管将2毫升单克隆抗体和2毫升1∶20倍稀释的补体输入子宫。然后提起后腿约1分钟。试验结果表明，后代中雌性占83.3%。实施例3应用H-Y单克隆抗体可使奶牛多生雌性。奶牛是单胎动物，因此不必作超排处理。于人工授精或交配后第3天和第5天，先直肠检查诊断黄体在那一侧卵巢，然后通过一市售的冲取胚胎所用的橡胶管，将H-Y单克隆抗体和1∶20倍稀释的补体各10毫升，输入黄体所在一侧的子宫角，随后用手通过直肠由后向前按摩子宫角1分钟。如怀雌性，则在282天前后出生，若怀有雄性，则被杀死，一个发情周期后又发情，这时可再配种或授精，并需再次输入H-Y单克隆抗体和补体。实施例4H-Y单克隆抗体的制备1、脾细胞的准备选取10只10周龄纯系C57BL/6雌性小鼠，用同系雄性小鼠的脾细胞经腹腔进行免疫，每7天一次，每次剂量为2.8×10^P6细胞，连续注射56-91天，于第42-77天时进行眼眶采血，用精子细胞毒试验检测血清抗体效价(其方法由Goldbery)描述，见Nature杂志232∶478，1971)。挑选4只血清抗体效价好的小鼠于最后一次免疫注射的第3天，眼眶放血致死小鼠无菌取出脾脏，用无血清DMEM培养液冲洗后置培养皿中，用6号针头在脾脏上扎数个小孔，用注射器通过4号针头向脾脏内注射DMEM，以便冲出脾细胞，细胞悬液经100目不锈钢筛过滤除去小组织块，取细胞样品计数。2、sp2/o骨髓瘤细胞的准备SP2/0骨髓瘤细胞，经快速解冻后，用无血清DMEM洗两遍以除去其中的冷冻保护剂，换上血清DMEM，并移入培养瓶中，置5%CO^Q2，37℃条件下培养，待其生长良好时，换以8-氮杂鸟嘌呤-DMEM继续培养3代，取部分细胞用HAT-DMEM选择培养液培养，证明细胞不能在其中生长时，恢复血清DMEM培养，待其达到对数生长期，取样计数，准备融合。3、饲养细胞的准备于融合前和每次克隆前准备饲养细胞。选择体格较大的C57BL/6雌性小鼠，断颈法处死后，消毒皮肤，无菌条件下向腹腔注射无血清DMEM10-15毫升，轻按腹部1-2分钟后，抽取腹水，离心弃上清液，换以含血清DMEM，分加在96孔培养板上，每孔0.1毫升，培养过夜。4、细胞融合及培养把脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按7.5∶1的比例混合于50毫升离心管中，100rpm(约200g)离心8分钟，尽量弃去上清液，用手指轻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种哺乳类动物生雌性控方法，其特征在于把Ｈ－Ｙ单克隆抗体和补体输入怀孕动物的子宫角，在怀孕动物体内杀死雄性胚胎。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文广，董伟，
申请(专利权)人：北京农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]