本发明专利技术公开了水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法，属食品安全检测领域，操作步骤是１、制备标准液；２、抽样，经捣碎取不少于５００克样品，均分二份在－１８℃下保存；３、提取，取５克样品，加入磷酸二氢钠，加水溶至５００毫升，制备成提取液３０毫升，二次均质离心取上清液，加三氯乙酸作备用液；４、净化，依次用甲醇、蒸馏水、三氯乙酸润洗，控制２０滴／ｍｉｎ，抽干后用５毫升乙腈洗脱；５、衍生，４０℃下氮气吹干，取０．５毫升标准液加入三氯乙酸和７％甲醛溶液混匀，密封置于沸水浴中加热３０ｍｉｎ，冷却后用乙腈洗脱溶液定容至１ＭＬ，过滤后供液相色谱检测，检测限小于５μｇ／ｋｇ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检 测方法，属于食品安全检测领域。
技术介绍
氨苄青霉素和阿莫西林药物的检测方法有薄层色谱法、毛细管电泳法、化学发光 法、液相色谱法和色谱联用技术。薄层色谱法，毛细管电泳法，化学发光法，方法简便，不需 昂贵的仪器，但检出限不高。高效液相色谱紫外检测法法稳定性高，重现性好，但是由于多 数青霉素化合物在紫外区没有特征吸收光谱，一般在20(T235nm有吸收，但该波长范围内 的选择性较差。色谱联用技术存在设备昂贵，对检测人员要求高，分析费时等问题。样品中 青霉素药物残留量为ug/L数量级，背景干扰严重，迄今尚未见对水产品中氨苄青霉素和阿 莫西林残留量既经济又正确的检测方法的报道，因而有加以研究的必要。
技术实现思路
本专利技术提出水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的一种检测方法是高效液相 色谱荧光检测法具体按下列步骤操作1.制备标准液 购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3Na04S)不少于 96. 5% ；阿莫西林标准品，含阿莫西林(C16H19N305S)不少于98. 5%。制备混合标准储备溶液准确称取氨苄青霉素10. Omg、阿莫西林10. Omg加水溶解 并稀释至浓度均为1. Omg/ml的储备液，本溶液于0°C 4°C保存，一周内有效。制备混合标准中间溶液准确移取混合标准储备溶液lOOyL，用水定容至 100mL，配成每升含氨苄青霉素1. Omg、阿莫西林1. Omg的混合标准中间溶液。制备混合标准工作溶液以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度 系列0. 1,1. 0,5. 0,20. 0、50. g/L ；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系 列1. 0,5. 0,20. 0,50. 0,100. 0u g/L0此标准工作液临用时现配。2.抽样本专利技术提供的检测方法，从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎 机捣碎。四分法缩分出不少于500g样品，混勻，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标 记。-18 °C以下冷冻保存。3.提取 称取5g样品(精确至O.Olg)置于50mL聚丙烯离心管中，加入1.68g 磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至500mL制备成提取液30mL，以lOOOOr/min均质3min， 再于室温下以3000 r/min离心lOmin，上清液移入离心管中，残留物用20mL提取液同上法 均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为750 mg/ml三氯乙酸 0. 5mL，振摇5min，3000 r/min离心lOmin，上清液做备用液。4.净化 固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水、加入浓度为200 mg/ml 三氯乙酸5mL润洗，将备用液过柱，控制速度在20滴/min，依次用浓度为200 mg/ml三氯乙酸5mL和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用5mL乙腈洗脱，真空抽干，收集洗脱液于离心管中。5.衍生 洗脱液在40°C下氮气吹干，加0. 5mL水溶解或准确量取0. 5mL的标准 工作液加入浓度为200 mg/ml三氯乙酸0. lmL和7%甲醛溶液0. lmL,旋涡混勻20s，密封， 置于沸水浴中加热30 min。取出，冷却至室温，用20%乙腈水溶液定容至lmL。6.过滤经0.45 ym微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。7.测定色谱测定条件为色谱柱C18柱，粒度5iim，4. 6mm (id) X 150mm，或性能相当者。检测器荧光检测器，Ex=380nm,Em=465nm。流速1. OmL/min。进样量50iiL。柱温40°C。流动相磷酸盐缓冲溶液(称取磷酸二氢钾2. 72g，用水溶解，再用85%的浓磷酸调 pH至3. 5士0.05，加水稀释至刻度，摇勻即得)一乙腈(75+25，v/v)。本专利技术提供的检测方法，通过衍生技术，在荧光检测器条件下，可以很大程度上提 高检测灵敏度。且检出限小于5ug/kg。解决了薄层色谱法，毛细管电泳法，化学发光法等 方法检出限高，以及紫外检测器条件下背景干扰严重的问题，并且与质谱相比，分析成本较 低。具体实施例方式1.制备标准液 购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3Na04S)不少于 96. 5% ；阿莫西林标准品，含阿莫西林(C16H19N305S)不少于98. 5%。制备混合标准储备溶液准确称取氨苄青霉素10. Omg、阿莫西林10. Omg加水溶解 并稀释至浓度均为1. Omg/ml的储备液，本溶液于0°C 4°C保存，一周内有效。制备混合标准中间溶液准确移取混合标准储备溶液lOOyL，用水定容至 100mL，配成每升含氨苄青霉素1. Omg、阿莫西林1. Omg的混合标准中间溶液。制备混合标准工作溶液以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系 列0. 1,1. 0,5. 0,20. 0,50. 0 u g/L ；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系 列1. 0,5. 0,20. 0,50. 0,100. 0u g/L0此标准工作液临用时现配。2.抽样从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。四分法缩分出不 少于500g样品，混勻，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。_18°C以下冷冻保存。3.提取 称取5g样品(精确至O.Olg)置于50mL聚丙烯离心管中，加入1.68g 磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至500mL制备成的提取液30mL，以lOOOOr/min均质3min， 再于室温下以3000 r/min离心lOmin，上清液移入离心管中，残留物用20mL提取液同上法 均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为750 mg/ml三氯乙酸 0. 5mL，振摇5min，3000 r/min离心lOmin，上清液做备用液。4.净化 固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水、加入浓度为200 mg/ml 三氯乙酸5mL润洗，将备用液过柱，控制速度在20滴/min，依次用浓度为200 mg/ml三氯乙 酸5mL和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用5mL乙腈洗脱，真空抽干，收集洗脱液于离心管中。5.衍生 洗脱液在40°C下氮气吹干，加0. 5mL水溶解或准确量取0. 5mL的标准4工作液加入浓度为200mg/mL三氯乙酸0. 1 mL和7%甲醛溶液0. lmL,旋涡混勻20s，密封， 置于沸水浴中加热30 min。取出，冷却至室温，用20%乙腈水溶液定容至lmL。6.过滤经0. 45 y m微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。7.测定色谱测定条件为色谱柱C18柱，粒度5iim，4. 6mm (id) X 150mm，或性能相当者。检测器荧光检测器，Ex=380nm,Em=465nm。流速1. OmL/min。进样量50iiL。柱温40°C。流动相磷酸盐缓冲溶液(称取磷酸二氢钾2. 72g，用水溶解，再用85%的浓磷酸调 pH至3. 5士0.05，加水稀释至刻度，摇勻即得)一乙腈(75+25，v/v)。本专利技术的水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的检测方法通过大黄鱼、南美白 对虾、扇贝和鱿鱼四种样品进行准确度、精密度和检出限的方法确认。一、准确度和精密度1)分别称取22份不含青霉素类本文档来自技高网...
【技术保护点】
水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于按下列步骤操作： （１）．制备标准液 购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素（Ｃ↓［１６］Ｈ↓［１８］Ｎ↓［３］ＮａＯ↓［４］Ｓ）不少于９６．５％；阿莫西林标准品，含阿莫西林（Ｃ↓［１６］Ｈ↓［１９］Ｎ↓［３］Ｏ↓［５］Ｓ）不少于９８．５％； 制备混合标准储备溶液：准确称取氨苄青霉素１０．０ｍｇ、阿莫西林１０．０ｍｇ加水溶解并稀释至浓度均为１．０ｍｇ／ｍｌ的储备液，本溶液于０℃～４℃保存，一周内有效； 制备混合标准中间溶液：准确移取混合标准储备溶液１００μＬ，用水定容至１００ｍＬ，配成每升含氨苄青霉素１．０ｍｇ、阿莫西林１．０ｍｇ的混合标准中间溶液； 制备混合标准工作溶液：以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列：０．１、１．０、５．０、２０．０、５０．０μｇ／Ｌ；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列：１．０、５．０、２０．０、５０．０、１００．０μｇ／Ｌ。此标准工作液临用时现配； （２）．抽样 本专利技术提供的检测方法，从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。 四分法缩分出不少于５００ｇ样品，混匀，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。－１８℃以下冷冻保存； （３）．提取 称取５ｇ样品（精确至０．０１ｇ）置于５０ｍＬ聚丙烯离心管中，加入１．６８ｇ磷酸二氢钠，加适量水溶解，定容至５００ｍＬ制备成提取液３０ｍＬ，以１００００ｒ／ｍｉｎ均质３ｍｉｎ，再于室温下以３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液移入离心管中，残留物用２０ｍＬ提取液同上法均质、离心所得二次上清液，合并二次上清液于离心管中，加入浓度为７５０ ｍｇ／ｍｌ三氯乙酸０．５ｍＬ，振摇５ｍｉｎ，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液做备用液； （４）．净化 固相萃取小柱预先依次用５ｍＬ甲醇、５ｍＬ蒸馏水、加入浓度为２００ ｍｇ／ｍｌ三氯乙酸５ｍＬ润洗，将备用液过柱，控制速度在２０滴／ｍｉｎ，依次用浓度为２００ ｍｇ／ｍｌ三氯乙酸５ｍＬ和蒸馏水洗涤，真空抽干，再用５ｍＬ乙腈洗脱，真空抽干，收集洗脱液于离心管中； （５）．衍生 洗脱液在４０℃下氮气吹干，加０．５ｍＬ水溶解或准确量取０．５ｍＬ的标准工作液加入浓度为２００ ｍｇ／ｍｌ三氯乙酸０．１ｍＬ和７％甲醛溶液０．１ｍＬ，旋涡混匀２０ｓ，密封，置于沸水浴中加热３０ ｍｉｎ。取出，冷却至室温，用２...
【技术特征摘要】
水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法，其特征在于按下列步骤操作(1).制备标准液 购买氨苄青霉素标准品，含氨苄青霉素(C16H18N3NaO4S)不少于96.5%；阿莫西林标准品,含阿莫西林(C16H19N3O5S)不少于98.5%;制备混合标准储备溶液准确称取氨苄青霉素10.0mg、阿莫西林10.0mg加水溶解并稀释至浓度均为1.0mg/ml的储备液,本溶液于0℃～4℃保存，一周内有效; 制备混合标准中间溶液准确移取混合标准储备溶液100μL，用水定容至100mL，配成每升含氨苄青霉素1.0mg、阿莫西林1.0mg的混合标准中间溶液; 制备混合标准工作溶液以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列0.1、1.0、5.0、20.0、50.0μg/L；以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列1.0、5.0、20.0、50.0、100.0μg/L。此标准工作液临用时现配; (2).抽样 本发明提供的检测方法，从原始样品中任意抽取样品，经高速组织捣碎机捣碎。四分法缩分出不少于500g样品，混匀，均分成两份。装入清洁容器，加封，标明标记。 18℃以下冷冻保存；(3).提取 称取...
【专利技术属性】
技术研发人员：王萍亚，周勇，黄鹂，薛超波，许镇坚，
申请(专利权)人：舟山市质量技术监督检测院，
类型：发明
国别省市：33[]
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