血吸虫童虫体外共培养方法技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，公开了一种血吸虫童虫的体外共培养方法，该共培养方法是将血吸虫童虫与其终宿主细胞共培养。实验表明本发明专利技术共培养方法所培养３天的日本血吸虫童虫不仅其外形、体表结构及体被结构等比常规体外培养方法所培养３天的童虫更加类似于宿主体内发育３日龄的肺期童虫，而且其基因表达和可溶性蛋白特征也更加接近于宿主体内发育童虫。本发明专利技术共培养方法是更接近于宿主体内环境的血吸虫体外培养方法，有利于血吸虫基因组学、后基因组学、转基因与蛋白质组学以及血吸虫病免疫学研究，同时为揭示血吸虫生长发育机制及其与宿主的相互关系研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及日本血吸虫人工转化童虫与其终宿主细胞的 体外新培养方法的建立。
技术介绍
血吸虫在终宿主体内的肺期童虫阶段，被视作宿主免疫系统攻击的最佳靶标，其 抗原可诱导Thl介导的保护性免疫反应。故肺期童虫的特异性靶分子被认为是血吸虫病新 一代疫苗的最佳候选分子，其筛选对血吸虫病疫苗的研制极为重要。然而，肺期童虫的材料 来源较为困难，从感染的终宿主体内获取的百分率仅为30%，从而影响大量靶抗原的提取 与对其特性的了解。目前国内外研究需要用到日本血吸虫童虫时常用体外常规培养方法 (周述龙，林建银，蒋明森。血吸虫学。北京科学出版社，2001。)——即以“841”培养基 中培养的血吸虫童虫替代。然而，研究显示(Chai M, McManus DP, McInnes R, et al. Cell Mol. Life Sci.，2006，63 (7-8) :919_929)，体外常规培养方法培养的日本血吸虫童虫，尽管 在超微结构上与终宿主体内童虫相差不大，但在基因表达上存在显著差别。由此认为，体外 常规培养方法培养的日本血吸虫童虫替代宿主体内童虫进行分子生物学与免疫学等研究 时尚需谨慎。为此，建立一种新的更接近于宿主体内环境的日本血吸虫童虫体外培养方法 成为当前血吸虫培养研究的重点方向之一。宿主的环境因子会影响血吸虫的生长、发育与基因表达(Chai M, McManus DP, McInnes R, et al. Cell Mol. Life Sci. ,2006,63(7-8) :919_929 ；Gobert GN, Chai M and McManus DP. Parasito 1.，2006，17 :1_8)。本专利技术将机械断尾的日本血吸虫童虫与其终宿主 细胞共培养，以期获得模拟宿主体内日本血吸虫正常生长发育的共培养条件，试图减少体 外培养的日本血吸虫童虫与宿主体内虫体在基因表达上存在的显著差异，为血吸虫分子生 物学与血吸虫病免疫学等研究提供更接近于宿主体内童虫的材料。专利技术人比较了共培养3 天童虫与宿主体内发育3天的肺期童虫、体外常规培养3天童虫之间在形态学、基因表达以 及可溶性蛋白表达等方面的差异。结果显示，共培养童虫的各指标更接近于宿主体内肺期 童虫。本专利技术所建立的共培养方法兼顾了童虫生长发育所需的营养成分以及宿主因子对其 生长发育影响这两方面的因素，避免了常规体外培养方法缺乏宿主因子作用的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血吸虫童虫体外培养的共培养方法，该培养方法中的 共培养童虫的各指标更接近于宿主体内肺期童虫。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下血吸虫童虫体外培养的共培养方法，该共培养方法是将血吸虫童虫与其终宿主细 胞共培养。其中，所述血吸虫童虫为人工转化童虫，具体为血吸虫尾蚴经人工脱去其尾部后 转化的童虫。其中，所述血吸虫为寄生人体的各种血吸虫，本专利技术实施方案中为日本血吸虫。其中，所述血吸虫童虫可以是转基因童虫。其中，所述终宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如来自人、鼠等，在本专利技术实施方 案中将血吸虫童虫与人肝静脉内皮细胞、人肺腺癌细胞以及鼠成纤维细胞等进行了共培养。其中，所述培养的方法是用终宿主培养基重悬血吸虫童虫，将其接种至经传代培 养20 30小时密度为1. OX IO5 3. OX IO5个/ml的宿主细胞上，调整虫体密度为400 500条/ml，于37°C、5% CO2的条件下培养，所述培养基优选为含有10%新生小牛血清的高 糖DMEM，附加常量抗生素，pH7. 2 7. 4。在本专利技术的实施例中，用含10%新生小牛血清的高糖DMEM(小牛血清与培养基均 为Gibco，Grand Island,New York产品)附加常量抗生素(终浓度青霉素为100IU/ml、链 霉素为100yg/ml)先以最佳密度传代人肝静脉内皮细胞(ED25)、人肺腺癌细胞(H1299)、 鼠成纤维细胞(3T3)，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，培养基的pH值为7. 2 7. 4。传代 20 30小时后，将机械断尾人工转化的日本血吸虫童虫以400-500条/ml的密度分别加入 各宿主细胞中共培养3天。本专利技术共培养方法具有如下优点1、共培养童虫的体长均比常规培养童虫的长，体宽均比常规培养童虫的窄，长宽 比值均比常规培养童虫的大，三项指标均与宿主体内童虫的更接近。2、共培养童虫的外形、体表结构与体被结构比常规培养童虫的更加类似于宿主体 内获得的童虫。3、与常规培养童虫相比，共培养童虫热休克蛋白(HSP)和细胞色素C氧化酶 (Cox)基因均为上调表达，组织蛋白酶L(Cath印sin L)、组织蛋白酶L酶原(Cath印sin L precursor)基因均下调表达，表达水平与宿主体内发育3天的童虫更接近。4、同一基因在宿主体内童虫与共培养童虫间的表达丰度较为接近，而体外常规培 养童虫与二者的差异较大。5、与常规培养的童虫比较，共培养童虫可溶性蛋白表达特性更加接近宿主体内获 得的肺期童虫。本专利技术提供一种促进体外培养童虫在形态学、基因表达以及可溶性蛋白表达等方 面与宿主体内肺期童虫更接近的共培养方法。由于血吸虫肺期童虫材料的获取是进行血吸 虫疫苗靶分子等相关研究的重要基础，本专利技术可以为血吸虫病疫苗与血吸虫蛋白质组学、 基因组学以及后基因组学等研究提供更接近于宿主体内状态的童虫材料；并且可以为血吸 虫转基因与血吸虫病免疫学以及抗虫药物筛选研究以及血吸虫生长发育机制及其与宿主 的相互关系研究提供极具价值的技术平台。附图说明图1.不同宿主细胞共培养日本血吸虫童虫光镜下形态观察，X 100。(A)与ED25 共培养3天的日本血吸虫童虫。(B)与H1299共培养3天的日本血吸虫童虫。(C)与3T3 共培养3天的日本血吸虫童虫。图2.不同培养方法日本血吸虫童虫光镜下形态观察，X100。(A)宿主体内肺期童虫。(B)与ED25共培养3天童虫。(C)体外常规培养3天童虫。图3.不同培养方法童虫扫描电镜形态观察(整体图)，X 1000。㈧宿主体内肺 期童虫。(B)与ED25共培养3天童虫。(C)体外常规培养3天童虫。图4.不同培养方法童虫扫描电镜形态观察(局部图)，X 5000。(A，B, C)宿主体 内肺期童虫。(D，E，F)与ED25共培养3天童虫。(G，H，I)体外常规培养3天童虫。(A，D， G)童虫前端。(B，E，H)童虫中部。(C，F，I)童虫末端。图5.不同培养方法童虫透射电镜形态观察(放大倍数见每幅标)。(A，D，G) 宿主体内肺期童虫。(B，E，H)与ED25共培养3天童虫。(C，F，I)体外常规培养3天童虫。 (A，B，C)横切面扫描图。(D，E，F)纵切面扫描图。(G，H，I)纵切面扫描图放大。(OP)外质 膜；(BL)基膜；(Ma)基质；(S)体棘；(CM)外环肌；(LM)内纵肌。图6.与ED25共培养3天童虫体被透射电镜观察，X 100000。“一”示7层外质膜， “ _ ”示指环体，“ ”示体棘。图7.同一基因在各组培养童虫表达水平检测。(A)宿主体内肺期童虫酶切双链 cDNA探针。(B)与ED25共培养3天童虫酶切双链cDNA探针。(C)体外常规培养3天童虫 本文档来自技高网...

【技术保护点】
血吸虫童虫体外共培养方法，其特征在于，该共培养方法是将血吸虫童虫与其终宿主细胞共培养。

【技术特征摘要】
血吸虫童虫体外共培养方法，其特征在于，该共培养方法是将血吸虫童虫与其终宿主细胞共培养。2.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于，所述血吸虫童虫为血吸虫尾蚴经 人工脱去其尾部后转化的童虫。3.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于所述血吸虫为日本血吸虫。4.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于，所述血吸虫童虫为转基因童虫。5.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于，根据共培养时间获得不同时期的 共培养童虫。6.根据权利要求1所述的共培养方法，其特征在于，所述终宿主细胞为哺乳动物细胞。7.根据权利要求6所述的共培养方法，其特征在于，所述终宿主细胞为人肝静脉内皮 细胞、人肺腺癌细胞或鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：董惠芬，叶青，赵琴平，明珍平，钟沁萍，朱俊勇，李瑛，蒋明森，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]