使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法技术

本发明专利技术提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。将第一种表达载体转化到第一种单倍体细胞中；并将第二种表达载体转化到第二种单倍体细胞中。鉴定各自合成不同多肽的这两种经转化单倍体细胞，然后进行遗传杂交或融合。将由此产生的二倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学功能的异聚多亚基蛋白。

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
重组蛋白生产是高通量筛选、功能验证、结构生物学、和药物多肽生产的一项必需 工作。大肠杆菌是广泛用于表达异源蛋白的生物体，因为它易于在便宜的培养基上生长至 高细胞密度，且具有完善建立的遗传技术和表达载体。然而，这对高效生产活性生物分子并 非总是足够的。为了保持生物学活性，多肽链必需折叠成正确的天然三维结构，包括适当形 成二硫键，而且可能还需要正确联合多种链。尽管蛋白质的活性状态在热力学上可能是有利的，然而折叠的时间量程可以由几 毫秒至几天变化。例如对亚基和亚结构域排列的需要导入了动力学屏障。而且，特别是真 核蛋白，为了形成正确折叠的蛋白质，必需发生共价反应。后一类反应包括二硫键的形成、 脯氨酸肽键周围多肽链的顺式/反式异构化、前蛋白质(preprotein)的加工、和辅基的连 接。这些动力学限制可能导致部分折叠中间物的积聚，而它们所包含的暴露的疏水性“粘 性”表面促进自我结合和集合体的形成。抗体是在临床诊断和治疗中具有许多用途的四聚体蛋白质。每个抗体四聚体由两 条相同的轻链和两条相同的重链组成。特定类型的纯粹人源或人源化抗体难以或不可能由 天然来源纯化足够数量以用于许多目的。结果是，生物技术和制药公司转向通过基于重组 DNA的方法来进行大规模制备。功能抗体的生产不仅需要合成两种多肽，而且需要许多翻译 后修饰，包括N端分泌信号序列的蛋白水解加工；多肽正确折叠和组装成四聚体；二硫键的 形成；和特定的N-连接糖基化。所有这些事件都发生在真核细胞分泌途径中，即真核细胞 独特的细胞器联合体。这些复杂蛋白质的重组合成必需依赖基于高等真核组织培养的系统来获得生物 学活性物质。然而，基于哺乳动物组织培养的生产系统显著比微生物发酵方法更加昂贵和 复杂。另外，关于使用衍生自动物副产品的物质来生产治疗性产品仍然存在怀疑。作为真核细胞，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)具有高等真核表达系统 的许多优点，诸如蛋白质加工、蛋白质折叠、和翻译后修饰，同时又像大肠杆菌或酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)那样易于操作。它比其它真核表达系统诸如杆状病毒或哺乳 动物组织培养要更快、更容易、且更便宜，而且通常得到更高表达水平。作为酵母，它享有与 糖酵母属一样的分子和遗传操作优势。这些特点使得毕赤氏酵母成为非常有用的蛋白质表 达系统。为糖酵母属开发的许多技术可应用于毕赤氏酵母属，包括互补转化、基因破坏、和 基因取代。另外，用于糖酵母属的命名法已应用于毕赤氏酵母属。糖酵母属和毕赤氏酵母 属二者基因产物之间还存在交叉互补。来自糖酵母属的几种野生型基因补足了毕赤氏酵母 属的对应突变基因。在巴斯德毕赤氏酵母中进行的异源表达可以是胞内的或分泌的。分泌要求所表达 蛋白质上存在信号序列，从而将它靶向分泌途径。尽管已经成功使用了几种不同的分泌信 号序列，包括一些异源蛋白上存在的天然分泌信号，然而结果是易变的。异源蛋白分泌的一 项潜在优势是巴斯德毕赤氏酵母分泌天然蛋白的水平很低。考虑到毕赤氏酵母基本生长培养基中蛋白质的数量很低，这意味着所分泌异源蛋白占据了培养基中总蛋白质的极大部 分，并且作为蛋白质纯化的第一步。许多酵母物种(包括毕赤氏酵母属)是能够进行交配的。这使得两种不同单倍体 菌株能够天然交配并生成具有两个染色体拷贝的二倍体物种。尽管巴斯德毕赤氏酵母已经成功用于生产多种异源蛋白，例如乙肝表面抗原 (Cregg 等，1987，Bio/Technology 5 :479)、溶菌酶、和转化酶(Digan 等，1988，Dev. Indust. Micro. 29 59 ；Tschopp 等，1987，Bio/Technology 5 :1305)，然而在毕赤氏酵母中生产其 它异源基因产物的努力(尤其是通过分泌)得到了不同的结果。在目前对巴斯德毕赤氏酵 母表达系统的理解水平，不能预测是否能够在这种酵母中将给定基因表达到明显水平，或 者毕赤氏酵母是否能够耐受在它的细胞中存在重组基因产物。另外，尤其难以预报特定蛋 白质是否会由巴斯德毕赤氏酵母分泌，以及效率如何(如果分泌的话)。本专利技术提供了用于由能交配的酵母(包括毕赤氏酵母属物种)分泌异源异多聚体 的改进方法。专利技术概述本专利技术提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。目 的异聚多亚基蛋白包含至少两种不同的多肽链，例如抗体的重链和轻链、MHC的α和β链、 诸如此类。为每一种不同多肽链提供表达载体。将每一种表达载体转化到单倍体酵母细胞中。在本专利技术的有些实施方案中，单倍 体酵母细胞是有遗传标记的，其中单倍体酵母细胞是互补对中的一员。将第一种表达载体 转化到第一种单倍体细胞中；并将第二种表达载体转化到第二种单倍体细胞中。通过直接 遗传融合使单倍体细胞发生交配，或者通过原生质球融合诱导相似事件。可以各个校准不同多肽在单倍体细胞中的表达水平，并通过适当的选择、载体的 拷贝数、启动子的强度和/或诱导、诸如此类进行调整。在本专利技术的一个实施方案中，每一 种表达载体中的启动子是不同的。在本专利技术的另一个实施方案中，为每一种表达载体提供 了相同的启动子。启动子可以是组成型的或诱导型的。鉴定各自合成不同多肽的经转化单倍体细胞，然后进行遗传杂交或融合。将由此 产生的二倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学功能的异聚多亚基蛋白。二倍体方 法学容许优化亚基配对，从而提高全长产物的生成和分泌。附图描述附图说明图1A-1D。组装完成的全长重组抗体的生成。使用免疫印迹检测方法学来鉴定各 自生成抗体一种亚基的亲本单倍体毕赤氏酵母菌株以及生成两种亚基并形成完整组装抗 体的目标二倍体菌株。图IA所示酵母菌株显示了各自代表性菌株的静态培养物，其中顶部 是分别含有重链(H)和轻链(L)亚基的不同单倍体菌株；底部是生成两种亚基的交配后稳 定的二倍体。图IB显示了重链的选择性检测，只发现于亲本重链单倍体以及含有重链和轻 链二者的交配后二倍体。图IC显示了重链和轻链的一般检测，它确定了所有三种菌株中生 成的蛋白质都是有活性的。图ID显示了二倍体菌株中正确组装的完整抗体的选择性检测， 确认了只有二倍体系统能够生成完整组装的抗体。图2。巴斯德毕赤氏酵母中全长抗体的生成。使用二倍体巴斯德毕赤氏酵母菌株 进行全长抗体的异源表达。使用蛋白A亲和层析由条件培养基分离所输出的抗体蛋白。显示了峰级分的等份试样。人IgG标准物衍生自纯化的合并人IgG。图3。由经改造生成全长小鼠/人嵌合抗体的二倍体巴斯德毕赤氏酵母菌株亚克 隆的培养基上清液检测和鉴定组装完成的抗体。用抗人Fc选择性抗体包被微量滴定板，由 培养基捕捉抗体。使用识别配对的重链CHl和κ轻链恒定区的人选择性(Fab' )2检测正 确组装的抗体。将澄清培养基的连续稀释液施加到板上。通过标准ELISA显像方法进行显 影。如图所示，检测是选择性的，mlgG标准物没有产生任何可检测信号。图4。由毕赤氏酵母生成的重组抗体以及传统哺乳动物衍生抗体将包含⑶3的 Jurkat T细胞染色。将Jurkat T细胞固定在载波片上，并使用在酵母和哺乳动物细胞中生 成的抗CD3抗体进行染色。使用生物素缀合抗啮齿类二抗进行检测，并用HRP-链霉亲和素 衍生物进行显影。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在酵母二倍体细胞中合成包含至少两个不同亚基多肽链的分泌型异聚多亚基蛋白的方法，该方法包括：用第一种表达载体转化第一种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第一种亚基且其可操作连接第一种酵母启动子；用第二种表达载体转化第二种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第二种亚基且其可操作连接第二种酵母启动子；由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体细胞；在所述第一种和第二种亚基表达且以所述多亚基蛋白的形式分泌的条件下培养所述二倍体细胞。

【技术特征摘要】
US 2003-10-22 60/513,876用于在酵母二倍体细胞中合成包含至少两个不同亚基多肽链的分泌型异聚多亚基蛋白的方法，该方法包括用第一种表达载体转化第一种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第一种亚基且其可操作连接第一种酵母启动子；用第二种表达载体转化第二种酵母单倍体细胞，所述表达载体包含所述蛋白质的第二种亚基且其可操作连接第二种酵母启动子；由所述第一种和第二种酵母单倍体细胞生成二倍体细胞；在所述第一种和第二种亚基表达且以所述多亚基蛋白的形式分泌的条件下培养所述二倍体细胞。2.依照权利要求1的方法，其中所述酵母二倍体细胞是毕赤氏酵母属的物种。3.依照权利要求2的方法，其中所述毕赤氏酵母属的物种选自下组巴斯德毕赤氏酵 母、Pichia methanolica、禾口 Pichia angusta。4.依照权利要求1的方法，其中所述异聚多亚基蛋白是包含至少重链和轻链的可变区 的抗体。5.依照权利要求4的方法，其中所述异聚多亚基蛋白是包含至少重链和轻链的可变区 和恒定区的抗体。6.依照权利要求4的方法，其中所述第一种表达载体包含轻链或重链序列的文库，且 所述第二种表达载体包含单一轻链或重链序列。7.依照权利要求4的方法，其中所述第一种表达载体包含轻链或重链序列的文库，且 所述第二种表达载体包含轻链或重链序列的文库。8.依...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM克里格，J莱瑟姆，M利顿，R沙茨曼，II托尔斯托鲁科夫，
申请(专利权)人：凯克研究生院，奥尔德生物制药公司，
类型：发明
国别省市：US[]