使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性制造技术

本发明专利技术的主题为检测微生物的抗生素耐受性的方法，其包括下列步骤：使疑似微生物与经（荧光）标记的抗生素接触，及观察其和同种无耐受性的微生物之间的差异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性本专利技术的主题为检测微生物的抗生素耐受性的方法。常规诊断方法中的微生物表征包括确定其种，及其对抗生素的敏感性。为实现这 点，需将微生物自其环境中分离，并于选择性环境富集，以便分离鉴定(ID)以及进行抗生 素敏感性测试(AST)。当前对微生物的AST/ID主要通过对其是否存在或缺少一系列生物化 学特性以及在抗生素存在下不能生长进行鉴定而实现。或可自样品中提取DNA，使用基因扩 增技术检测经合并的DNA中特定序列的存在/缺失情况。这可告知样品中存在生物体。同 样的，可对样品中编码抗生素耐受性的基因的存在情况进行检测。根据定义，直接自样品中 提取DNA可从未知的细胞混合物中得到合并的DNA。仅当自纯集落提取DNA时，方可得到明 确的结果。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为最常见的基于医院或社区感染的病 因，引发具有高发病率和高死亡率的疾病。由于甲氧西林(或类似物)被认为是治疗葡萄球 菌感染的首选，近些年，显示对甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐受的细菌株数 量的增长已成为一项严峻的临床及流行病学问题。对该抗生素的耐受意味着对所有内 酰胺抗生素耐受。由于上述的这些原因，准确而迅速地检测甲氧西林耐受性，对确保感染的 患者的正确的抗生素治疗以及控制医院环境中的MRSA单离物以避免其扩散是关键的。MRSA株具有mecA基因，其编码与甲氧西林及所有β -内酰胺抗生素亲和性低的经 修饰ΡΒΡ2蛋白(ΡΒΡ2’或PBP2a)。甲氧西林耐受性的表型表达可根据金黄色葡萄球菌的生 长条件(如温度或培养基渗透压)而改变。而这可影响用于检测甲氧西林耐受性的方法的 准确度(1)。杂耐受性的细菌株可发展成为全耐受性株，且可在接受β -内酰胺抗生素的患 者体内被筛选，导致治疗失败。因此，从临床的观点看，应将它考虑为全耐受的。已存在几种检测甲氧西林耐受性的方法(1，9)，包括测定最低抑菌浓度MIC (盘 扩散、E试验、或肉汤稀释)的经典方法，使用含苯唑西林的固体培养基的筛选技术，以及检 测mecA基因或其蛋白产物(PBP2’蛋白)的方法(3，4)。mecA基因的检测可被作为测定甲 氧西林耐受性的参照方法(1)。但是世界上很多实验室并不具备所需资金，能力或有经验的 工作人员来提供检测MRSA单离物的分子试验。因此需将更实用的筛选方法并入常规临床 实践中。此外，抗生素耐受性的存在具有几种水平的其关联性，其全部具有临床意义。1.存在提供耐受性的基因，如meCA、mef(E)，2.存在抑制上述耐受性机制的表型表达的阻遏物基因，如，MecA阻遏物，3.多重耐受性机制如通过核糖体结合位点的修饰的大环内酯耐受性以及存在 外排机制4.通过作为表型可检测的转录及翻译调控的上述耐受性机制的表达水平。当前的培养技术需要离散集落的单离及随后鉴定和耐受性测试，假定单集落源于 单个细胞，则其可由此被视为是纯的。然而事实上，无法确保自病原体通常存活于生物膜群 落中的临床样品产生纯集落。同样，使用扩增技术对来自多个细胞的核酸序列提取及扩增， 且可因此呈现出假阳性的结果。仅当在单个细胞执行并读取鉴定和耐受性的信息时，方可 对该侵入的病原体正确描绘。众多抗生素携带有伯氨基。在
中众所周知的，如异硫氰酸荧光素(FITC)， 荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯的试剂均易与上述伯胺基反应。随着抗生素耐受性在社区及卫生保健系统中传播速度的不断加快，分子生物学的 测定精度与速度显得尤为重要。然而，这些实验的复杂性以及花费限制了其在常规测试环 境中更广泛的应用。考虑到在生物样品中鉴定微生物及其潜在的抗生素耐受性的困难，希望可在无需 培养及扩增的情况下，直接自样品中快速识别病原体，还能检测或排除对所选抗生素的耐 受性的存在。本专利技术意图提供能在细胞水平上同时实现鉴定与耐受性检测的解决方案。其减少 了试验的复杂性，并可对单独的细胞均做出明确的表型判断。该试验被设计为旨在减少允 许筛选程序(就例如MRSA而对新来的患者进行筛选)的操作以及周转时间。本专利技术的第一方面为用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的方法。包 括下列步骤(a)提供经记的抗生素，(b)使所述经标记的抗生素与含所述微生物的生物样品在允许所述经标记的抗生 素与所述微生物中的其结合位点相结合的条件下接触，(c)检测所述微生物中的所述经标记的抗生素，及(d)鉴定所述可检测的标记物的量随着所述非耐受形式的预定微生物中的所述可 检测标记物的量而改变的微生物。其中步骤(d)中鉴定的微生物是对所述抗生素耐受的微生物。本方法的基本原理为如果生物体对抗生素敏感或耐受，其将显著不同于与其耐 受性或敏感性对应生物体。抗生素可与在细胞腔、细胞质、细胞壁或如β-内酰胺酶的分泌 出的蛋白中任意处的其相应结合位点相结合。依靠其耐受性机制，耐受型生物通常因与例 如核糖体或青霉素结合蛋白亲和力下降，表现出对抗生素的亲和力下降或无亲和力。相反 的，如果耐受性机制为将抗生素吸收/吸附到胞外膜，耐受型生物将显示出高度增强的荧 光。所述生物样品可以是生物学来源的任何疑似含有抗生素耐受型微生物的样品，如 临床或食物样品。该微生物可选自细菌、酵母及霉菌，特别是选自革兰氏阳性和革兰氏阴 性菌。所述预定微生物优选选自葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus) 以及链球菌(Streptococcus)。所述预定微生物更优选选自甲氧西林耐受型葡萄球菌、万古霉素耐受型葡萄球 菌、万古霉素耐受型肠球菌、以及高水平氨基糖苷耐受型肠球菌。微生物可再更优选选自金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌 (MRSA)、万古霉素耐受型金黄色葡萄球菌(VRSA)、万古霉素耐受型葡萄球菌(VRS)、万古霉 素耐受型肠球菌(VRE)、肺炎链球菌、药物耐受型肺炎链球菌(DRSP)和氨基糖苷耐受型肠 球菌(HLAR)。步骤(a)中提供的抗生素可以为任何抗生素。所述抗生素优选选自氨基糖苷类、 碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、单菌胺类、内酰胺抗生素类、喹诺酮类、杆菌肽、磺胺类、四环素类、链阳菌素类、氯霉素、克林霉素以及林肯胺。所述抗生素更优选选自β -内酰胺抗生素类、大环内酯类、林肯胺以及链阳菌素 类。所述抗生素再更优选选自阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链 霉素、妥布霉素、氯碳头孢、厄他培南、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑 啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头 孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢磺 啶、头孢吡肟、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹 桃霉素、氨曲南、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、二氯唑西林、氟氯西 林、美洛西林、萘夫西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙 星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、 磺胺米隆、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶、 甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的方法，包括下列步骤：　　（ａ）提供经标记的抗生素，　　（ｂ）使所述经标记的抗生素与含所述微生物的生物样品在允许所述经标记的抗生素与所述微生物中的其结合位点相结合的条件下接触，　　（ｃ）检测所述微生物中的所述经标记的抗生素，及　　（ｄ）鉴定所述可检测的标记物的量随着所述非耐受形式的预定微生物中的所述可检测标记物的量而改变的微生物，　　其中步骤（ｄ）中鉴定的微生物是对所述抗生素耐受的微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：I斯普敦，W斯坦因，
申请(专利权)人：米阿科姆诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]