用于收集及处理ＤＮＡ和ＲＮＡ检测样品的方法、试剂盒和系统技术方案

本发明专利技术涉及用于收集和处理样品以释放和处理用于基因序列检测的ＤＮＡ和ＲＮＡ的方法、试剂盒和系统。本文所述方法从组织和细胞材料中迅速简便地释放并回收ＤＮＡ和ＲＮＡ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于收集及处理DNA和RNA检测样品的方法、试剂盒和系统相关申请的交叉引用本专利申请根据美国法典第35条119款要求提交于2008年5月19日的美国临 时申请61/U8238的优先权。专利
本专利技术涉及收集及处理生物学样品(例如植物和动物组织等)用于分析或鉴定 (检测)特定基因组材料(DNA和RNA)目的的方法；并且还涉及用于实施该方法以及检测 此类材料的试剂盒和系统。专利技术背景来自昆虫的微生物、细菌和病毒病原体是威胁人类和动物健康并极大增加食品生 产成本和财政风险的有害物剂。这些威胁在农场和水产业以及其中“牲畜”在高强度生产设 施中生长的环境下是尤其真实的。目前很好地建立了通过基因组材料经由PCR、RT-PCR(其 中PCR指聚合酶链反应而RT-PCR指反转录PCR)和基因测序检测并鉴定这些物剂的方法并 且提供了检测和控制这些物剂的可用方法。然而，应用这些方法直接检测水产业、农业、环 境和临床样品中包含的核酸已经常常证明是无效的，并且多半是不可能的。已知这种检测无效的多个原因。这些原因包括实际上靶核酸很多情况下包含在或 定位于微生物内部并且位于宿主的组织内部。这种定位可致使微生物的基因组材料(“靶 核酸”)不可用于直接检测。因此，需要一种释放并溶解靶核酸的方法来用于检测。在已知 的方法中，靶核酸与抑制剂和细胞及组织中包含的大量宿主DNA和RNA结合，使得靶核酸的 检测复杂化。动物、海洋和环境样品被样品中的固体沉淀物、胶体、乳液、可溶解的和不溶解的 盐、生物大分子、生物可降解碎片、惰性材料和污染的工业化学品和天然化学制品进一步复 杂化。这些样品的异质性和复杂性可抑制直接的核酸检测方法或使其无效。当颜色是分析 或检测方法的一部分时，样品着色也会干扰测试结果。在多种情况下微生物和病原体的直接检测被进一步复杂化，因为样品仅包含靶基 因组材料的一些拷贝。此外，在一些样品中靶基因组材料很多情况下与样品中存在的大量 来自宿主和非靶生物的基因组材料一起存在。因为靶标的低拷贝数和高浓度的背景基因组 材料和抑制剂，直接检测方法如PCR、RT-PCR和免疫测定方法的灵敏度和特异性受到化学 干扰并且无法有效进行检测。为了避免这些问题，需要一些形式的样品处理以从干扰材料中浓缩、纯化并释放 出靶基因组材料。已开发了多种样品制备方法以避免由于基因组定位、抑制剂和无效的基 因组检测引起的灵敏度丧失和不良特异性产生的不精确及假性结果。一般来讲，这些处理方法涉及i)破坏组织并溶解细胞以释放靶基因组材料，ii) 将基因组材料吸附在固体支持体如膜或吸附剂材料上，iii)洗涤吸附的基因组材料使其不 含污染物，以及iv)从固体支持体上释放基因组材料用于检测。虽然上述方法已经证明对检测和鉴定基因组材料是有用的，但它们仍需要在分析前进行多步骤处理以纯化并分离基因组材料。此类方法不但需要使用支持设备和材料(例 如离心、膜过滤和/或化学沉淀)，它们还可能需要毒性化学制品和溶剂以稳定基因组材料 并有助于从固体支持体中释放基因组材料。这些方法不但增加了分析的复杂性、成本和时 间，而且还可能需要在实验室中使用真空或电气设备。因此，仍需要一种检测有害物剂如包括细菌和病毒病原体在内的微生物的方法， 该方法能够在现场使用，不需要实验室真空或电气设备，使用迅速且简便，不需要无毒的化 学制品，成本低廉并且能够基于诊断基因序列用于病原体的迅速检测和鉴定。“现场”是指 例如生长或生产或加工食物产品的场所，包括但不限于农场(水产业和农业)、食品加工和 包装场所等。为了监控和控制有害微生物及控制它们引起的病害，还需要简单的样品处理技 术，该技术能够在现场使用以从样品中收集、处理和回收基因组材料，其中发现的微生物对 其靶核酸进行分析。本专利技术满足了这些需要。专利技术概述本专利技术通过提供一种柔性壁容器和用于收集并处理样品中核酸的方法以及适用 于该方法的诊断系统来解决上述问题，所述诊断系统包括一个试剂盒，其中该方法能以低 成本操作、使用简便并且能够在现场使用。所述方法包括收集并处理基因组材料，它们是来 自样品的核酸)，不需要对样品基因组材料进行纯化。所述方法能够与试剂盒一起使用以 提供对动物和植物流体或组织中包含的细菌和病毒病原体的低成本的、迅速的原位(在现 场)检测。本专利技术的一个目标是提供有效的、简便的、迅速的和廉价的容器和方法以收集并 回收样品中的核酸用于靶核酸或特定基因序列的分析或鉴定。该方法能够在现场使用。本 专利技术的另一个目的是提供释放并溶解核酸以及使得它们不含干扰溶质和抑制剂(其能抑 制或减少检测结果)的方法。本专利技术的另一个目的是提供廉价的试剂盒和诊断系统以达到 前述目标。本专利技术提供用于收集、处理并分析样品中的靶核酸的方法、试剂盒和系统。该方法 包括(a)提供包含核酸的样品；(b)将所述样品转移到柔性壁容器中；(c)将萃取液加到容 器中；(d)用萃取液和一种或多种处理试剂在容器中处理所述样品以从样品中释放核酸以 溶解核酸并产生回收液；以及(e)将一部分来自步骤(d)的回收液或产物转移到合适的检 测系统以用于靶核酸的检测。步骤(d)中的“处理”在本文是指包括将样品与萃取液和一种或多种处理试剂混 合并且任选地处理混合物，例如用萃取液和一种或多种处理试剂浸软样品。任选地，可在转移样品至容器之前将一种或多种处理试剂加到容器中。一种或多 种处理试剂可有助于释放并溶解核酸和/或移除或灭活抑制物质(“抑制剂”)，所述抑制 物质干扰靶核酸中的基因序列的后续检测。也可加热或冷冻柔性壁容器以灭活抑制剂和/ 或保存或稳定核酸。任选地，柔性壁容器可包含过滤介质以利于在步骤(d)之后和步骤(e)之前，在已 经释放并溶解核酸后除去微粒。适用的检测系统使用PCR、RT-PCR、等温扩增、基因测序或探针杂交技术。还提供一个试剂盒，该试剂盒提供材料和容器以制备样品并经由PCR、RT-PCR、等 温扩增、基因测序或探针杂交技术检测或鉴定诊断性靶DNA或RNA。该试剂盒包括(a)在其 内处理样品的柔性壁容器，(b)萃取液，(c) 一种或多种处理试剂和(d)移液管，该移液管 用于收集并测量用萃取液和一种或多种处理试剂在容器中处理样品而产生的回收液，并且 用于将回收液转移到合适的检测系统中。该试剂盒还可包括压碎装置用于辅助压碎固体样 品，以及过滤装置。该试剂盒还可包括检测介质，它包含一种或多种检测试剂用于PCR、RT-PCR、等温 扩增、基因测序或探针杂交产物的检测和鉴定。该试剂盒通常还包括描述使用试剂盒组件进行样品制备和诊断性靶DNA或RNA核 酸检测的方法的说明书。还提供了诊断系统，它用于样品制备和样品中包含的靶核酸的检测或鉴定。该系 统包括如上文所述的试剂盒以及检测系统。该检测系统取决于靶核酸是DNA或RNA、或cDNA 产物。该检测系统或试剂盒包括检测介质。该检测系统包括用于检测DNA或RNA、或cDNA 产物的处理器。检测可使用PCR、RT-PCR、等温扩增、基因测序或探针杂交技术完成。完成 检测的处理器包括热循环仪或烘箱式加热器。该检测系统还包括检测方法。检测方法可选自标准非变性凝胶电泳(例如丙烯酰 胺或琼脂糖)、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳、或荧光检测。术语和缩写以下缩写和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于收集、处理及分析来自样品的靶核酸的方法，所述方法包括：　　（ａ）提供包含核酸的样品；　　（ｂ）将所述样品转移到柔性壁容器中；　　（ｃ）将萃取液加入到所述容器中；　　（ｄ）用所述萃取液和一种或多种处理试剂在所述容器中处理所述样品以从所述样品中释放核酸以溶解所述核酸并产生回收液；以及　　（ｅ）将一部分来自步骤（ｄ）的回收液或产物转移到合适的检测系统以用于所述靶核酸的检测。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-5-19 61/1282381.用于收集、处理及分析来自样品的靶核酸的方法，所述方法包括(a)提供包含核酸的样品；(b)将所述样品转移到柔性壁容器中；(c)将萃取液加入到所述容器中；(d)用所述萃取液和一种或多种处理试剂在所述容器中处理所述样品以从所述样品中 释放核酸以溶解所述核酸并产生回收液；以及(e)将一部分来自步骤(d)的回收液或产物转移到合适的检测系统以用于所述靶核酸 的检测。2.权利要求1的方法，其中所述样品包含固体材料，并且所述处理步骤(d)包括用所述 萃取液和一种或多种处理试剂在所述容器中混合并浸软所述样品以帮助释放所述核酸。3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种处理试剂包含裂解剂，所述裂解剂包含去 污剂、酶、或者它们的组合；pH在7至7. 8范围内的缓冲液；氯化镁；和氯化钾。4.权利要求2的方法，其中所述样品是虾组织，所述核酸是虾病原体的诊断剂，并且其 中所述病原体选自白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、桃拉综合征病毒、以 及哈氏弧菌。5.试剂盒，所述试剂盒提供材料和容器以制备样品并检测或鉴定诊断性靶DNA或RNA， 所述试剂盒包括(a)柔性壁容器，样品在该柔性壁容器中进行处理，(b)萃取液，(c)一种或多种处理试剂，以及(d)移液管，所述移液管用于收集并测量用所述萃取液和一种或多种处理试剂在所述 容器中处理所述样品而产生的回收液，并且用于将所述回收液转移到合适的检测系统中。6.权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：RC埃伯索尔，JA里文巴克，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]