一种提取和纯化CRM197蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种提取和纯化CRM197蛋白的方法，属于疫苗制备技术领域。具体而言，本发明专利技术采用无信号肽、无融合标签添加的方法在大肠杆菌细胞质中表达CRM197蛋白，并将菌体进行渗透压法（反复冻融+高渗溶液+低渗溶液）处理以提取细胞质中可溶性表达的CRM197蛋白，然后经过两步柱层析（阴离子柱层析+疏水柱层析），获得较高纯度的目标蛋白。本发明专利技术提供的CRM197蛋白提取和纯化方法简单、高效、易于操作、无需复杂设备辅助，且具有成本优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种提取和纯化crm197蛋白的方法，属于疫苗制备。

技术介绍

1、crm197蛋白作为白喉毒素的无毒突变体（第52位甘氨酸突变为谷氨酸），因其保留完整免疫原性且无毒性，已成为多糖结合疫苗的核心载体蛋白，广泛应用于肺炎球菌、脑膜炎球菌等疫苗中。白喉棒状杆菌是生产crm197蛋白的天然宿主，但其生产效率较低，生产成本高且生物安全性要求较高。因此人们尝试了大量其它生物进行异源表达crm197蛋白，例如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、荧光假单胞菌及大肠杆菌等。其中大肠杆菌因其遗传背景清楚，表达产量高，生产成本低，安全性较高等优点，是异源表达crm197蛋白的优选宿主。

2、大肠杆菌中表达crm197蛋白常表现为包涵体形式，不利于后期的蛋白纯化和大规模的工业化生产，因此人们常采用各种手段促进crm197在大肠杆菌中表达为可溶形式。一种常用的手段是在crm197原本氨基酸序列n端添加信号肽，由信号肽引导crm197蛋白到氧化环境较好的细胞周质中进行表达，促进二硫键的正确折叠，减少包涵体形成。但周质容积仅占细胞15%，产量受限，并且此技术还存在信号本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种提取和纯化工程菌细胞质中可溶性表达的CRM197蛋白的方法，其特征在于，采用渗透压法提取CRM197蛋白，并采用两步柱层析法纯化CRM197蛋白，其中：

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2和/或步骤S3中，冰水浴和离心参数为：冰水浴孵育20min后将菌体12000rpm离心10min。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高渗溶液为：50mM Tris，10mM EDTA，20%蔗糖，pH=8.0。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子柱层析中，洗脱液梯度为：10%B，20%B，30%B，100%B。

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【技术特征摘要】

1.一种提取和纯化工程菌细胞质中可溶性表达的crm197蛋白的方法，其特征在于，采用渗透压法提取crm197蛋白，并采用两步柱层析法纯化crm197蛋白，其中：

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2和/或步骤s3中，冰水浴和离心参数为：冰水浴孵育20min后将菌体12000rpm离心10min。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高渗溶液为：50mm tris，10mm edta，20%蔗糖，ph=8.0。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子柱层析中，洗脱液梯度为：10%b，20%b，30%b，100%b。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于，疏水柱层析中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张年，白津，杨敏，张超，何刚，黄放，黄倩，陈苗苗，谢蓉娴，李若玥，王倩，周冬梅，熊骏民，段梦奇，
申请(专利权)人：复星安特金成都生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：