一种用于基因插入的供体片段的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，特别是针对一种用插入的供体片段的构建方法。(1)根据基因组序列设计引物，对基因组进行PCR；(2)根据质粒序列设计引物，将质粒或携带质粒的目标细胞进行PCR；(3)将(1)中的待插入位点上下游片段以及(2)中的线性化质粒经纯化试剂盒纯化后共同通过吉布森组装；(4)重组质粒转化到的目标细胞进行筛选获得重组成功的转化子；(5)设计引物对(4)中的获得的转化子进行PCR扩增，设计引物对待插入DNA片段进行扩增，经过纯化试剂盒纯化后通过吉布森组装；(6)将(5)中的片段转化到目标细胞进行筛选后获得携带供体片段的转化子；(7)将(6)中的转化子通过PCR或酶切法获得供体片段。本发明专利技术本方法可以有效的减少基因扩增次数和转化次数，降低突变发生的概率，缩短供体片段的构建时长，减轻实验人员的劳动强度，节约试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，特别是针对一种用于基因插入的供体片段的构建方法。

技术介绍

1、同源重组(homologous recombination)是指发生在非姐妹染色单体(non-sisterchromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的dna分子之间或分子之内的重新组合。基于同源重组的基因组编辑具有脱靶少甚至无脱靶、无残留等优点。

2、在大肠杆菌基因工程领域，基于λ噬菌体red操纵子的red同源重组系统是使用最为广泛的同源重组系统之一。

3、使用大肠杆菌red系统同源重组系统进行大肠杆菌基因插入时，需要构建供体片段，传统的供体片段构建方法若要构建较长的同源臂需要以pcr单独扩增上游片段、下游片段、插入片段，再以overlap-pcr将上游片段、下游片段、插入片段构建成完整的供体片段。

4、构建过程失败率高，突变可能性大。

技术实现思路

1、本专利技术提出了一种基于吉布森组装和pcr的敲除和敲入用同源重组所需供体片段的构建方法，能有效地降低供体片段构建过程中供体本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于基因插入的供体片段的构建方法,包括如下步骤，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)或(5)中若用提取后的质粒作为PCR模板获得线性化质粒，应在PCR产物纯化后用DpnI酶进行切割。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物1与引物2设计是基因组定点插入需求，应在设计插入位点两侧、符合同源臂设计长度要求的区段内；依据吉布森组装规划带有或不带有吉布森组装所需的同源臂设计。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的引物3与引物4依据将引物1和引物2PCR所得片段整合入目标质粒设计；依...

【技术特征摘要】

1.一种用于基因插入的供体片段的构建方法,包括如下步骤，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)或(5)中若用提取后的质粒作为pcr模板获得线性化质粒，应在pcr产物纯化后用dpni酶进行切割。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物1与引物2设计是基因组定点插入需求，应在设计插入位点两侧、符合同源臂设计长度要求的区段内；依据吉布森组装规划带有或不带有吉布森组装所需的同源臂设计。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的引物3与引物4依据将引物1和引物2pcr所得片段整合入目标质粒设计；依据吉布森组装规划带有或不带有吉布森组装所需的同源臂设计。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的引物5与引物6依据吉布森组装规划带有或不带有吉布森组装所需的同源臂设计。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的引物7与引物8依据吉布森组装规划带有或不带有吉布森组装所需的同源臂设计。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标细胞为a673细胞、cho-s细胞、cho细胞、vero细胞、sf9细胞、293f细胞、hek293t细胞、植物细胞、酿酒酵母菌、产油酵母、茶酵母、啤酒酵母、斯氏油脂酵母、红法夫酵母、产阮假丝酵母、异型酒香酵母、裂殖酵母、乌瓦酵母、维哈克莫酵母、毕赤酵母、圆红冬孢酵母、二裂酵母、克鲁维酵母、白色隐球菌、米曲霉、碳曲霉、顶头孢霉、灰霉菌、产黄青霉、黑根霉、根霉、四孢脂霉、哈茨木霉、小根霉、假木霉、多孢木霉、尼泊尔重霉、泡盛曲霉、灰黄青霉、赭曲霉、费氏曲霉、潮解木霉、粉红单端孢霉、毛霉、短帚霉、韦氏曲霉、黑曲霉、农霉菌、变异霉菌、托米木霉、枸橼木霉、菌核青霉、乌瓦曲霉、短青霉、意大利青霉、柑橘青霉、黄曲霉、烟曲霉、里氏木霉、红曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、委内瑞拉链霉菌、波塞链霉菌、白链霉菌、灰链霉菌、白芥链霉菌、嗜热链球菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：杭州元腾生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：