【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及木薯memyb基因、受ga诱导myb转录因子功能验证的方法。
技术介绍
1、木薯(manihot esculenta crantz)是世界三大薯类作物之一，起源于热带美洲，因其适应性强，耐旱、耐贫瘠等优势而被广泛栽培于热带和部分亚热带地区，是热带湿地低收入农户的主要食粮。自2008年国家木薯产业技术体系成立以来，越来越多的科研工作者致力于木薯研究。木薯全产业链的研究包含木薯种质资源、木薯遗传育种、木薯栽培、木薯采后加工等方面。而关键基因的发掘对木薯育种乃至全产业链的研究有重要意义。myb转录因子是植物代谢网络中最重要的转录调控因子之一，控制植物的生长发育、信号转导、次生代谢以及在生物和非生物胁迫中也产生重要作用。gamyb是一个受赤霉素ga调控的编码一个r2r3-myb dna结合结构域的myb类转录因子，在植物生长发育过程中起着重要作用，是ga信号应答途径中首个被鉴定出来的正向作用的因子。ga是一类重要的植物激素，其在植物开花诱导、果实发育以及次生代谢产物的合成等过程起着重要作用。本研究提供一种受ga调控的myb转录因子，对木薯次生代谢物如花青素、类胡萝卜素等的合成调控有着重要作用。
2、基因功能验证一般采用本底遗传转化的方式，但是存在周期长的缺陷，甚至有一些植物自身遗传转化体系尚未成熟。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种受ga诱导myb转录因子功能验证的方法，通过在真核酵母种验证基因功能，具有快速、可靠的优
2、为实现上述目的，采用以下技术方案：提供一种受ga诱导myb转录因子功能验证的方法，包括以下步骤：
3、步骤s1.megamyb基因的克隆；通过pcr方法扩增获得含有碱基序列1533bp片段的木薯megamyb基因；
4、步骤s2.megamyb基因的亚细胞定位；
5、步骤s3.megamyb基因的酵母自激活验证；
6、步骤s4.megamyb基因的ga诱导功能验证；
7、其中，步骤s4具体方法包括：
8、s4-1.采用同源重组方法，将megamyb基因构建到酵母表达载体pdr196中，构建好的重组载体分别命名为pdr196-megamyb，将重组质粒转化至酵母菌株w303；
9、s4-2.pdr196-megamyb酵母表达载体ga3诱导表达。
10、优选地，步骤s1中，采用pcr的方法，sc9木薯叶片cdna为模板，设计特异引物扩增megamyb基因，全长扩增引物的正向引物megamyb-f为atgagcaaaatgacaaatgg，反向引物megamyb-r为ctagcattcgctatcaatat。
11、优选地，步骤s2中，megamyb基因的亚细胞定位引物的正向引物megamyb-gfp-f为
12、agtggtctctgtccagtcctatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-gfp-r为
13、ggtctcagcagaccacaagtctagcattcgctatcaatat。
14、优选地，步骤s3中，megamyb基因的酵母自激活引物的正向引物megamyb-bd-f为
15、atggaggccgaattcatgagcaaaatgacaaat，
16、反向引物megamyb-bd-r为
17、cgacggatccccgggctagcattcgctatcaatat。
18、优选地，步骤s4-1具体方法包括：
19、s4-1-1.制备w303感受态细胞
20、保存的w303菌种在固体培养基ypda上划线，30℃培养3天，挑取单菌落接种至ypda液体培养基中，od600达到0.4～0.5后，3000g离心5分钟，弃去上清，用10ml溶液a重悬菌体，3000g离心5分钟，弃去上清；在沉淀中加入1ml1*te/liac进行重悬，即获得酵母感受态细胞，按50μl分装于无菌冻存管备用；
21、s4-1-2.转化w303
22、配置预混液，取360μl预混液加入感受态细胞w303中，高速混匀，使酵母细胞完全悬浮于液体中；置于30℃水浴热激45～60分钟，每10-15分钟混匀一次，结束后3000g离心3分钟，弃上清，用0.9％nacl重悬后涂于sd+葡萄糖固体板上，30℃倒置培养2～3天。
23、优选地，步骤s4-2具体方法为：挑选阳性克隆加入到sd/-ura液体培养基中，30℃，220rpm摇动培养过夜，调整至od600至1.0，依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5μl点在sd/-ura+10mm ga3平板上，待吸收完全后30℃培养箱中培养3天；以正常培养作为对照，比较转pdr196-megamyb和pdr196空载体质粒的酵母菌株的生长情况；说明megamyb在能在ga3条件下生长比对照好。
24、优选地，megamyb基因的酵母功能验证引物的正向引物megamyb-pdr196-f为
25、atataccccagcctcgatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-pdr196-r为
26、cgataagcttgatatcctagcattcgctatcaat。
27、本专利技术另一目的在于提供一种木薯megamyb基因，采用pcr方法扩增得到其核苷酸序列如seq id no：1所示的木薯megamyb基因。
28、本专利技术具有以下的有益效果：
29、1.本专利技术通过pcr方法，设计全长扩增引物扩增获得含有碱基序列1533bp片段的木薯megamyb基因。
30、2.本专利技术通过设计megamyb的亚细胞定位引物，megamyb定位在细胞核中。
31、3.本专利技术通过设计megamyb的自激活引物，采用酵母自激活验证方法，显示与pgbkt7(bd)-megamyb对pgadt7(ad)无激活功能，与空ad/bd一致，不存在互作关系，即megamyb无自激活活性。
32、4.本专利技术通过设计megamyb的酵母功能验证引物，采用ga诱导功能验证方法，以正常培养作为对照，比较转pdr196-megamyb和pdr196空载体质粒的酵母菌株的生长情况。结果显示pdr196-megamyb在ga3条件下生长比对照好，megamyb能受ga诱导。
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1.一种受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤S1中，设计特异引物扩增MeGAMYB基因，全长扩增引物的正向引物MeGAMYB-F为ATGAGCAAAATGACAAATGG，反向引物MeGAMYB-R为CTAGCATTCGCTATCAATAT。
3.根据权利要求1所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤S2中，MeGAMYB基因的亚细胞定位引物的正向引物MeGAMYB-GFP-F为AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTATGAGCAAAATGACAAAT，反向引物MeGAMYB-GFP-R为GGTCTCAGCAGACCACAAGTCTAGCATTCGCTATCAATAT。
4.根据权利要求1所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤S3中，MeGAMYB基因的酵母自激活引物的正向引物MeGAMYB-BD-F为ATGGAGGCCGAATTCATGAGCAAAATGACAAAT，反
5.根据权利要求1所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于，步骤S4-1具体方法包括：
6.根据权利要求1所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于，步骤S4-2具体方法为：挑选阳性克隆加入到SD/-Ura液体培养基中，30℃，220rpm摇动培养过夜，调整至OD600至1.0，依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5μL点在SD/-Ura+10mM GA3平板上，待吸收完全后30℃培养箱中培养3天；以正常培养作为对照，比较转pDR196-MeGAMYB和pDR196空载体质粒的酵母菌株的生长情况；说明MeGAMYB在能在GA3条件下生长比对照好。
7.根据权利要求6所述的受GA诱导的木薯MYB转录因子功能验证方法，其特征在于：MeGAMYB基因的酵母功能验证引物的正向引物MeGAMYB-pDR196-F为ATATACCCCAGCCTCGATGAGCAAAATGACAAAT，反向引物MeGAMYB-pDR196-R为CGATAAGCTTGATATCCTAGCATTCGCTATCAAT。
8.一种木薯MeGAMYB基因，其特征在于：采用权利要求1的PCR方法扩增得到其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的木薯MeGAMYB基因。
...【技术特征摘要】
1.一种受ga诱导的木薯myb转录因子功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的受ga诱导的木薯myb转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤s1中，设计特异引物扩增megamyb基因，全长扩增引物的正向引物megamyb-f为atgagcaaaatgacaaatgg，反向引物megamyb-r为ctagcattcgctatcaatat。
3.根据权利要求1所述的受ga诱导的木薯myb转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤s2中，megamyb基因的亚细胞定位引物的正向引物megamyb-gfp-f为agtggtctctgtccagtcctatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-gfp-r为ggtctcagcagaccacaagtctagcattcgctatcaatat。
4.根据权利要求1所述的受ga诱导的木薯myb转录因子功能验证方法，其特征在于：步骤s3中，megamyb基因的酵母自激活引物的正向引物megamyb-bd-f为atggaggccgaattcatgagcaaaatgacaaat，反向引物megamyb-bd-r为cgacggatccccgggctagcattcgctatcaatat。
5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗秀芹，韦卓文，薛晶晶，蔡杰，安飞飞，陈松笔，张贝，罗秀平，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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