【技术实现步骤摘要】
本申请涉及一种氨肽酶及其制备方法和应用，属于生物催化剂。
技术介绍
1、肌肽（l-carnosine，l-car）是由 l-组氨酸和 β-丙氨酸两种氨基酸组成的二肽，在动物体内可以合成，是目前为止发现广泛存在的活性肽之一。
2、目前，l-肌肽的生产方法分为化学合成法和生物合成法。化学合成法是目前工业生产最为常用的方法，大多需要对氨基酸进行保护或去保护，工艺复杂，且副产物多，溶剂消耗较大，环境污染严重。生物合成法即酶法合成 l-肌肽相较于传统的化学合成方法，具有反应条件温和、产物纯度高、收率高、环境污染小等优点。
3、2018年，kino 等研究者在枯草芽孢杆菌中发现 l-氨基酸连接酶可以用于 l-肌肽的合成，但反应需要大量 atp 参与，增加了制备成本。
4、二肽水解酶可以通过催化 l-肌肽的水解的逆反应合成 l-肌肽，2019年，殷东亚课题组通过基因组挖掘获得来自粘质沙雷氏菌的二肽水解酶 smpepd，并发现 smpepd 的活性可被 mn2+ 激活，经优化后的酶可以催化得到 l-肌肽15.2 g/l；2023年，饶志明课题组对运用蛋白质组合工程和转运工程对 smpepd 进行定向突变和基因敲除，最终生产 l-肌肽133.2 mmol/l；2024年，朱敦明课题组对产气荚膜梭菌二肽酶基因 cppepd 进行突变，通过高通量筛选，获得了合成活性提高2.2倍的突变体，在底物浓度为6mol/l β-丙氨酸和0.2mol/l l-组氨酸时，生产15.16 g/l l-肌肽。
5、早期发现
6、综上所述，目前所报道的氨肽酶存在着催化活性低、反应时间长、产物浓度低等问题，因此需要开发性能更好的氨肽酶催化剂，以满足工业生产需求。
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请提供了一种新的氨肽酶及其编码基因和含有该编码基因的重组氨肽酶作为催化剂/转化剂在l-肌肽合成中的应用。
2、具体地，本申请是通过以下方案实现的：
3、本专利技术的第一方面，提供一种氨肽酶（dmpa），所述氨肽酶包含有如seq id no：2所示的氨基酸序列。优选的，所述氨肽酶在seq id no：2所示的氨基酸序列的n端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白。
4、本专利技术的第二方面，提供一种用于编码氨肽酶的核酸，所述核酸的核苷酸序列如seq id no：1所示。
5、seq id no：1由微小囊担子菌 mca4210进行illumina miseq测序得到：以微小囊担子菌 mca4210的总dna为模板，以引物dmpa-f 5'和dmpa-r 5'为扩增引物，并在在引物dmpa-f 5'上引入 ecori 酶切位点，在引物 dmpa-r 5'上引入 hind iii 酶切位点，选择高保真primestar hs dna polymerase with gc buffer（takara）进行pcr扩增，其中：
6、dmpa-f 5'：atgggtcgcggatccgaattcttagtaagcatggcgggtcacgat；
7、dmpa-r 5'：ctcgagtgcggccgcaagcttatggaacgtaaacgtatccgcgaact。
8、本专利技术的编码前述氨肽酶的核酸，可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。
9、本专利技术的编码所述氨肽酶的核酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》（j.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995）。包括但不限于重组dna技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸pcr法。
10、本专利技术的第三方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含有seq idno：1对应的核酸。
11、优选的，所述重组表达载体由seq id no：1对应的核酸克隆到表达载体中获得。
12、本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述重组表达载体。这些方法包括重组dna技术、dna合成技术等。可将编码所述氨肽酶的dna有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mrna合成进而表达氨肽酶，或者用于同源重组。本专利技术的较佳案例中，所述表达载体采用pet-28a。
13、本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，所述细胞包含有前述重组表达载体或基因组中整合有外源的seq id no：1对应的核酸。优选的，所述细胞采用大肠杆菌，如大肠杆菌bl21（de3）。
14、本专利技术的第五方面，提供了上述氨肽酶的制备方法：培养前述宿主细胞，使之诱导表达含有如seq id no:2的氨肽酶。优选的，诱导温度为16~37℃，表达时长为8~28 h，诱导剂为iptg，浓度为0.2~1.0 mmol/l。更优选的，诱导温度为16~25℃，表达时长为12~16 h，诱导剂为iptg，浓度为0.2~0.6 mmol/l。
15、本专利技术的第六方面，提供上述氨肽酶、核酸、重组表达载体或宿主细胞用于l-组氨酸（l-histidine）和β-丙氨酸甲酯盐酸盐（β-alanine methyl ester hydrochloride）生成l-肌肽（l-carnosine）的用途：将氨肽酶、核酸、重组表达载体或宿主细胞作为转化剂，添加到含l-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的缓冲溶液中，使l-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐转化为l-肌肽。优选的，缓冲溶液中，l-组氨酸浓度为20~70g/l，β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度为40~100g/l。转化温度为10~35℃，转化ph即缓冲溶液的ph为5~10。更优选的，转化温度为15~25℃，缓冲溶液的ph为8~10，l-组氨酸与β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度比为5~8:10。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
17、本专利技术从微小囊担子菌 mca4210中克隆出一个新的氨肽酶基因 dmpa，为利用基因工程技术构建具有高效氨肽酶酶重组菌提供了更多的基因资源。通过基因工程手段，将dmpa基因在大肠杆菌中进行了异源表达，获得了高效表达氨肽酶的重组菌。建立该重组菌对l-肌肽的生物转化工艺，可以高效催化l-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐缩合，制备l-肌肽。氨肽酶具有酶活性高，酶促反应水平高等优点，特别是在底物l-组氨酸浓度70g/l、β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度为100g/l时，能够生产55g/l l-肌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨肽酶，其特征在于：所述氨肽酶包含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种用于编码氨肽酶的核酸，其特征在于：所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于编码氨肽酶的核酸，其特征在于：以微小囊担子菌MCA4210的总DNA为模板，以引物DmpA-F 5'和DmpA-R 5'为扩增引物，在引物 DmpA-F 5'上引入 EcoRI 酶切位点，在引物 DmpA-R 5'上引入 Hind III 酶切位点，
4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含有SEQ ID NO：1对应的核酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含有权利要求4所述重组表达载体或基因组中整合有外源的SEQ ID NO：1对应的核酸。
6.一种氨肽酶的制备方法，其特征在于：培养权利要求5所述宿主细胞，使之诱导表达含有序列SEQ ID NO:2的氨肽酶。
7.根据权利要求6所述的一种氨肽酶的制备方法，其特征在于：诱导表达温度为16~37℃，表达时长为8~28 h，诱
8.一种权利要求1所述氨肽酶、权利要求2或3所述核酸、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞用于L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐生成L-肌肽的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：将氨肽酶、核酸、重组表达载体或宿主细胞作为转化剂，添加到含L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐的缓冲溶液中，使L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯盐酸盐转化为L-肌肽。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：缓冲溶液中，L-组氨酸浓度为20~70g/L，β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度为40~100g/L；转化温度为10~35℃，缓冲溶液pH为5~10。
...【技术特征摘要】
1.一种氨肽酶，其特征在于：所述氨肽酶包含有如seq id no：2所示的氨基酸序列。
2.一种用于编码氨肽酶的核酸，其特征在于：所述核酸的核苷酸序列如seq id no：1所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于编码氨肽酶的核酸，其特征在于：以微小囊担子菌mca4210的总dna为模板，以引物dmpa-f 5'和dmpa-r 5'为扩增引物，在引物 dmpa-f 5'上引入 ecori 酶切位点，在引物 dmpa-r 5'上引入 hind iii 酶切位点，
4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含有seq id no：1对应的核酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含有权利要求4所述重组表达载体或基因组中整合有外源的seq id no：1对应的核酸。
6.一种氨肽酶的制备方法，其特征在于：培养权利要求5所述宿主细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：王培，孙晓瑄，汪佳萍，张保国，禹卫东，孟祥燕，孙铭杰，
申请(专利权)人：浙江震元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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