一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺制造技术

技术编号：40942764 阅读：2 留言：0更新日期：2024-04-18 14:59

本申请提供一种提高发酵单位与糖酸转化率的L‑酪氨酸发酵工艺，属于以发酵方法合成氨基酸技术领域。将TYR042接种至LB摇瓶灭菌培养基中，振荡培养得到摇瓶种子液；摇瓶种子液通过火焰法接种至种子罐的种子培养基中，培养得到成熟的种子液；成熟种子液加压转接到发酵罐的发酵培养基中，代谢合成目标产物L‑酪氨酸；发酵结束后，加热发酵液保温灭活菌体，冷却至室温后转移至纯化工序。上述方案中KH<subgt;2</subgt;PO<subgt;4</subgt;和木糖用量显著减少。在50 L发酵罐水平24 h L‑酪氨酸的发酵单位达到102.8 g/L，糖酸转化率60.0%。

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【技术实现步骤摘要】

本申请涉及一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，属于以发酵方法合成氨基酸。

技术介绍

1、l-酪氨酸(l-tyrosine)，又称为2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸，是一种条件必需氨基酸，亦是三大芳香族氨基酸之一，广泛应用于药品、食品、饲料和日化等领域。在人体内可以促进甲状腺激素和黑色素的合成，对人的发育和新陈代谢具有重要的作用。l-酪氨酸是合成l-左旋多巴的前体，而l-左旋多巴是有效治疗帕金森的药物；另外，l-酪氨酸也可以作为苯丙酮尿症患者的饮食补充剂。

2、目前经典l-酪氨酸生产方法主要有蛋白质水解法、酶法、化学合成法和微生物发酵法四种。

3、蛋白质水解法面临原料来源有限，水解条件苛刻，产物组成复杂和纯化步骤长等问题已被逐渐淘汰。

4、酶法制备l-酪氨酸面临酶制备成本高，易失活，稳定性差，反应条件比较严格等缺点从而限制了酶法的大规模应用。

5、化学合成法得到外消旋物dl-酪氨酸，需进一步拆分才能得到目标产物l-酪氨酸，工艺繁琐，反应条件苛刻，效率低，环境污染严重，不符合国家绿色发展的政策要求。

6、微生物发酵法是利用廉价的葡萄糖或者甘油等作为碳源，性能优良的微生物在适当的发酵条件下从头合成目的产物l-酪氨酸，具有原料来源广泛，能耗低，对环境友好的优势，适合大规模工业化生产。但人工诱变等传统育种方法的作用靶点往往集中在局部的代谢途径或者关键酶上，难以对l-酪氨酸代谢流造成较大的影响，并且诱变所得菌株的遗传背景不清晰，不利于后续进一步的遗传改造。

<p>7、近年来，随着代谢工程和合成生物学的快速发展，使理性设计和改造微生物特定代谢途径逐渐成为研究热点。为了满足不断增长的l-酪氨酸需求量，构建高性能的基因工程菌和优化最适的发酵工艺是提高l-酪氨酸产量最重要的两个关键点。然而，目前有关的l-酪氨酸的文献和专利侧重点主要集中在基因工程菌构建或者发酵培养基组分优化等方面，而对发酵工艺的研究比较少，使工程菌的潜力未能充分释放。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请提供一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，该工艺在构建高性能基因工程菌的基础上，所提供的发酵工艺，在最大程度上提高了l-酪氨酸产量，特别是发酵单位和糖酸转化率方面提高尤为明显，这为进一步提高发酵法的工业化水平提供了技术保障，可以满足市场对l-酪氨酸日益增长的需求。

2、具体地，本申请是通过以下方案实现的：

3、一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，包括以下步骤：

4、步骤一，将大肠埃希氏菌(escherichia coli)tyr042接种至lb摇瓶灭菌培养基中，振荡培养得到摇瓶种子液。

5、步骤二，摇瓶种子液采用火焰法接种至种子罐的种子培养基中，培养得到成熟的种子液，培养过程中定时检测种子液生物量od600、残糖含量、nh4+和溶磷浓度，并利用尾气分析仪实时检测、计算得到的微生物生理参数摄氧率(oxygen uptake rate，our，下同)和co2释放速率(carbon-dioxide escape rate，cer，下同)作为种子成熟的指标，确定最佳移种时间，即成熟种子液的移种时间；

6、步骤三，成熟种子液加压转接到发酵罐的发酵培养基中，代谢合成目标产物l-酪氨酸，发酵过程中通过溶氧、ph、our和cer生化指标参数变化及时调整补糖速率，既要保持发酵液中低浓度葡萄糖又要避免葡萄糖积累，使l-酪氨酸合成通路持续高效运行；

7、步骤四，发酵结束，发酵液加热至设定温度并保温灭活菌体后，冷却至室温，转入纯化工序。

8、上述方案中，以摇瓶种子液为引，先将其接种在种子培养基中配以得到种子液，再将种子液转接到发酵培养基中发酵合成含目标产物l-酪氨酸的发酵液，最后将发酵液加热至一定温度后，保温灭活菌体，冷却至室温，转入提取纯化工序中。上述过程中，分别控制不同参数来确定高活力成熟种子液的转接移种时间和补糖速率，实现种子液成熟节点和移种时间的精准控制，同时补糖速率的控制避免了葡萄糖的积累，确保合成通路的高效运转，从而实现发酵单位和糖酸转化率处于较高水准。

9、进一步的，作为优选：

10、步骤一中，

11、所述lb摇瓶灭菌培养基配方为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l。

12、所述菌株tyr042于30～35℃、180～250rpm条件下振荡培养16～18h。

13、步骤二中：

14、所述种子培养基配方为：葡萄糖15～25g/l，酵母浸粉0.5～2g/l，硫酸铵1～2g/l，二水柠檬酸三钠1.4～2g/l，k2hpo4·3h2o 5.5～6.5g/l，mgso4·7h2o 1.4～2g/l，feso4·7h2o 0.0014～0.0035g/l，mnso4·h2o0.0008～0.0016g/l，消泡剂0.2～0.5ml/l。121℃灭菌30min，初始糖需要单独灭菌，121℃灭菌20min，在接种前利用蠕动泵将初始糖泵如种子罐中。更优选的，所述种子培养基中k2hpo4·3h2o含量为2.5～3.5g/l。

15、所述摇瓶种子液的接种量为0.2～0.5％；接种前即将种子培养基的ph调整至6.8～7.0，培养温度设定为35～37℃，种子罐内压力为0.03～0.06mpa，全程通风量为4～8m3/h，通过自动控制流加氨水维持发酵液ph在6.8～7.0，溶氧与转速联动，通过控制转速100-350rpm维持溶氧在25～35％；控制培养16～19h，此时od600为8～10。

16、上述培养过程中，定时检测种子液生物量od600、残糖含量、nh4+和溶磷浓度，通过尾气分析仪检测氧气和二氧化碳的含量，计算our和cer。

17、步骤二中，our为15～35m·mol/(l*h)，cer为15～30m·mol/(l*h)时，种子活力达到最大，为成熟种子移种时间。

18、步骤三中：

19、成熟种子液的接种量为10～15％，培养温度为35～37℃，发酵培养基ph保持在6.8～7.0，发酵罐内压力为0.04～0.07mpa，整个发酵时长为37～42h，培养得到含有l-酪氨酸的发酵液；所述发酵培养分为三个阶段：发酵初始阶段，维持溶氧在30～40％；初始糖耗尽ph和溶氧升高时，进入补料阶段，控制补入的葡萄糖速率，确保发酵液中残糖浓度不超过1.0g/l，发酵液溶氧20～25％；od600达到130～150时，补糖速率每小时降低1.0g/(l*h)，直至发酵后期维持在5.0g/(l*h)。

20、步骤三中，our为170～220m·mol/(l*h)，cer为210～240m·mol/(l*h)，此时菌种的活力达到最大，l-酪氨酸的合成速率达到最快。

21、所述发酵培养基配方为：葡萄糖15～30g/l，酵母浸粉0.5～1.5g/l，硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，所述种子培养基配方为：葡萄糖15～25 g/L，酵母浸粉0.5～2 g/L，硫酸铵1～2 g/L，二水柠檬酸三钠1.4～2 g/L，K2HPO4·3H2O5.5～6.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.4～2 g/L，FeSO4·7H2O 0.0014～0.0035g/L，MnSO4·H2O 0.0008～0.0016 g/L，消泡剂0.2～0.5 mL/L。

3. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，步骤二中，所述摇瓶种子液的接种量为0.2～0.5%；培养过程中，培养温度为35～37℃，种子培养基pH保持在6.8～7.0，种子罐内压力为0.03～0.06MPa，全程通风量为4～8m3/h，溶氧维持在25～35%；控制培养16～19h时的OD600为8～10。

4. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵

5. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，步骤三的发酵培养中，接种量为10～15%，培养温度为35～37℃，发酵培养基pH保持在6.8～7.0，发酵罐内压力为0.04～0.07MPa，整个发酵时长为37～42 h，培养得到含有L-酪氨酸的发酵液；所述发酵培养分为三个阶段：发酵初始阶段，维持溶氧在30～40%；初始糖耗尽pH和溶氧升高时，进入补料阶段，控制补入的葡萄糖速率，确保发酵液中残糖浓度不超过1.0 g/L，发酵液溶氧20～25%；OD600达到130～150时，降低补糖速率补糖速率每小时降低1.0 g/(L*h)，直至发酵后期维持在5.0 g/(L*h)。

6. 根据权利要求5所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，所述葡萄糖浓度为600～700g/L，最大补糖速率不超过20 g/（L*h）。

7. 根据权利要求5所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于：发酵至12～14 h时，分多次补充40%消泡液。

8. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于：步骤三中，OUR为170～220 m·mol/（L*h），CER为210～240 m·mol/（L*h）。

9. 根据权利要求1～8任一项所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖15～30 g/L，酵母浸粉0.5～1.5 g/L，硫酸铵1.2～2 g/L，一水柠檬酸1.5～2.5 g/L，K2HPO4·3H2O6～9 g/L，MgSO4·7H2O 1～3 g/L，FeSO4·7H2O 0.0656～0.0856 g/L，MnSO4·H2O 0.004～0.006 g/L，Na2SO4 0.01～0.03g/L，ZnSO4 0.0054～0.0074 g/L，CoCl2·6H2O 0.003～0.005 g/L，CuSO4·5H2O 0.0005～0.0007 g/L。

10. 根据权利要求9所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的L-酪氨酸发酵工艺，其特征在于：发酵至20～24 h时开始补加K2HPO4溶液，补加速率为50～80 g/（L*h），K2HPO4液浓度为180～220g/L。

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【技术特征摘要】

1.一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，所述种子培养基配方为：葡萄糖15～25 g/l，酵母浸粉0.5～2 g/l，硫酸铵1～2 g/l，二水柠檬酸三钠1.4～2 g/l，k2hpo4·3h2o5.5～6.5 g/l，mgso4·7h2o 1.4～2 g/l，feso4·7h2o 0.0014～0.0035g/l，mnso4·h2o 0.0008～0.0016 g/l，消泡剂0.2～0.5 ml/l。

3. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，步骤二中，所述摇瓶种子液的接种量为0.2～0.5%；培养过程中，培养温度为35～37℃，种子培养基ph保持在6.8～7.0，种子罐内压力为0.03～0.06mpa，全程通风量为4～8m3/h，溶氧维持在25～35%；控制培养16～19h时的od600为8～10。

4. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，步骤二中，our为15～35 m·mol/（l*h），cer为15～30 m·mol/（l*h）时，为成熟种子移种时间。

5. 根据权利要求1所述的一种提高发酵单位与糖酸转化率的l-酪氨酸发酵工艺，其特征在于，步骤三的发酵培养中，接种量为10～15%，培养温度为35～37℃，发酵培养基ph保持在6.8～7.0，发酵罐内压力为0.04～0.07mpa，整个发酵时长为37～42 h，培养得到含有l-酪氨酸的发酵液；所述发酵培养分为三个阶段：发酵初始阶段，维持溶氧在30～40%；初始糖耗尽ph和溶氧升高时，进入补料阶段，控制补入的葡萄糖速率，确保发酵液中残糖浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊伟明，陈燕娜，王克非，王培，孟祥燕，谢华丽，禹卫东，
申请(专利权)人：浙江震元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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