【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫应答和肿瘤生物治疗领域，尤其涉及一种新型的实体肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆性cd8 t细胞的鉴定、体外扩增及应用方法。
技术介绍
1、恶性肿瘤是严重危害我国公众健康的重大疾病，据国家癌症中心发布的统计数据，我国仅2015年一年新增癌症病例就高达392.9万，死亡病例233.8万，二者均高居世界第一。机体的免疫系统可以主动识别肿瘤抗原，发挥免疫监视功能，在早期清除发生癌变的细胞。但是，在特定情形下，肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸策略逃脱机体的免疫监视，形成原发性肿瘤，并建立抑制性肿瘤微环境，抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤生长与进展。
2、激活的肿瘤抗原特异性的cd8 t细胞所介导的抗肿瘤免疫应答是机体对抗肿瘤发生发展的主要途径。cd8 t通过其t细胞受体(tcr)识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原肽-mhc i类分子复合物，特异性地杀伤肿瘤细胞，从而在机体的抗肿瘤免疫中扮演关键作用。但是，一旦肿瘤细胞通过免疫编辑(immunoediting)突破免疫监视，会快速增殖，形成肿瘤组织，并建立抑制性免疫微环境。在此情形下，肿瘤组织内的肿瘤抗原及免疫抑制性分子(pd-l1,cd48，galectin-1,ido及il-10等)通过tcr及共抑制信号途径，持续刺激肿瘤特异性的cd8 t细胞，最终使之分化为终末耗竭的cd8 t细胞(exhausted t cell,tex)。与耗竭t细胞相对应的概念是效应t细胞(effector t cells,teff)及记忆性t细胞(memory tcells,tmem)。效应性t
3、目前针对cd8 t细胞耗竭的免疫策略主要是阻断抑制性受体相关信号通路，以pd-1/pd-l1阻断抗体为代表的免疫检查点阻断疗法在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌及肾癌的治疗中取得了较好的效果，中位疗效持续时间约为传统化疗的2-3倍，然而患者反应率最高不超过30％。此外，临床研究发现在初始阶段响应的病人在后期会出现耐药抵抗或复发，只有极少数病人(<5％)可被临床治愈。
4、目前，领域内大多数的观点认为，肿瘤组织浸润的耗竭前体细胞(progenitorexhausted t cell,tpex)是响应pd-1免疫检查点治疗的关键细胞亚群。但是，这一细胞亚群在浸润的肿瘤特异性cd8 t细胞所占比例较低，其增殖潜力有限，很难解释pd-1免疫检查点阻断疗法显著的抗肿瘤效应。并且，研究表明，肿瘤组织浸润的耗竭cd8 t细胞各亚群呈现相对固化的表观遗传及转录状态,pd-1免疫检查点阻断很难改变已经固化的表观遗传特性。进一步提升pd-1免疫检查点阻断疗法的响应率及持续效应是肿瘤免疫治疗领域目前面临的重大挑战。未来取得突破的关键之一可能在于厘清、鉴定响应pd-1免疫治疗的新的关键cd8 t细胞亚群，并阐明其响应的分子调控机制。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种新型的实体肿瘤引流淋巴结(tumor draining lymph nodes,tdln)内抗原特异性记忆性cd8 t细胞及其鉴定、扩增和应用。本专利技术利用流式细胞分选及分析技术，鉴定了新型的富集于小鼠肿瘤引流淋巴结内的具有记忆细胞特征的、非耗竭的肿瘤特异性cd8 t细胞。此独特的细胞亚群高表达记忆t细胞表面分子cd62l、cd127、cd122、ccr7，不表达抑制性受体tim3、lag3、cd39，2b4，使其区别于肿瘤内浸润的耗竭前体细胞及其它耗竭细胞亚群；表达cd44(源自人的细胞为cd45ra-cd45ro+)而区分于初始cd8 t细胞；高表达转录因子tcf-1而区分于效应cd8 t细胞；表达低水平pd-1而区分于经典的记忆性cd8 t细胞。这一新型细胞亚群对持续补充及维持肿瘤组织内浸润(tumorinfiltrating t cells,tils)的耗竭cd8 t细胞各亚群至关重要。更重要的是，这一细胞亚群是持续响应肿瘤pd-1/pd-l1免疫检查点阻断疗法的关键细胞亚群。
2、在一个方面，本专利技术提供了一种源自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性cd8 t细胞(下文称为“本专利技术的细胞”或“本专利技术的cd8t细胞”或“本专利技术的新型细胞群体”)，其特征在于，是具有以下标志物组合的细胞：活化的cd62l+pd1low/dimtim3-cd8+t细胞。
3、在一个优选实施方案中，本专利技术的细胞是：
4、对于小鼠肿瘤来源：
5、cd44+cd62l+cd127+cd122+ccr7+pd1low/dimtim3-cd39-lag3-cd8+t细胞；
6、对于人肿瘤来源：
7、cd3+cd4-cd45ra-cd45ro+cd62l+cd127+cd122+ccr7+pd1low/dim tim3-cd39-lag3-cd8+t细胞。
8、在一个方面，本专利技术的新型细胞群体的特征在于，高表达cd122，cd62l，cd127，ccr7，缺失表达2b4,lag3,tim3，cd39，表达较低水平的抑制性受体pd-1，优选地，本专利技术的新型细胞群体高表达转录因子tcf-1并且能够持续响应pd-1/pd-l1免疫检查点阻断疗法。
9、在另一个方面，本专利技术提供了分离自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性cd8 t细胞在抗肿瘤中的应用。在一个具体实施方案中，本专利技术提供了所述t细胞在用于抑制肿瘤生长的过继细胞转移疗法中的用途，即将富集的或增殖的自身的或非自身的所述t细胞注射/回输至患者体内。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤选自黑色素瘤和和卵巢癌。在一个具体实施方案中，所述t细胞与pd-1/pd-l1免疫检查点阻断疗法共同施用，优选地，所述pd-1/pd-l1免疫检查点阻断疗法是抗pd-l1或pd-1抗体。
10、在又一个方面，本专利技术提供了从肿瘤引流淋巴结分离本专利技术所述的t细胞的方法，包括下列步骤：
11、a.从小鼠或人实体肿瘤引流淋巴结获取单细胞悬液；
12、b.从上述单细胞悬液分选活化的cd62l+pd1low/dimtim3-cd8+t细胞，
13、优选地，对于小鼠，从所述单细胞悬液分选
14、cd44+cd62l+cd127+cd122+ccr7+pd1low/dimtim3-cd39-lag本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种源自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性T细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的细胞：
2.根据权利要求1所述T细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的T细胞：
3.根据权利要求1或2所述的T细胞，其中所述T细胞通过流式细胞术或磁珠分选获得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的T细胞，其特征在于，高表达CD122，CD62L，CD127，CCR7，缺失表达2B4,LAG3,Tim3，CD39，表达较低水平的抑制性受体PD-1，并且高表达转录因子TCF-1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的T细胞，其特征在于，能够持续响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法。
6.权利要求1-5中任一项定义的T细胞在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，优选地，所述T细胞通过过继细胞转移疗法而抑制肿瘤生长；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤和卵巢癌。
7.权利要求1-5中任一项定义的T细胞与PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法的组合在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，优选地，所述T细胞通过过继细胞转移疗法而抑制肿瘤生长；
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法是抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项定义的T细胞和药学上可接受的载体。
10.一种分离抗原特异性记忆性CD8+T细胞的方法，包括下列步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种源自肿瘤引流淋巴结的抗原特异性记忆性t细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的细胞：
2.根据权利要求1所述t细胞，其特征在于，是具有以下标志物组合的t细胞：
3.根据权利要求1或2所述的t细胞，其中所述t细胞通过流式细胞术或磁珠分选获得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的t细胞，其特征在于，高表达cd122，cd62l，cd127，ccr7，缺失表达2b4,lag3,tim3，cd39，表达较低水平的抑制性受体pd-1，并且高表达转录因子tcf-1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的t细胞，其特征在于，能够持续响应pd-1/pd-l1免疫检查点阻断疗法。
6.权利要求1-5中任一项定义的...
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