一种新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，包括以下步骤：培养并收集巴氏梭菌菌体，离心、洗涤完成后加入SMP buffer重悬，再加入载体质粒或甲基化处理的质粒混匀，所得混悬液在冰浴条件下超声，将超声后的混悬液转入电转杯进行电击处理，电击后迅速加入培养基复苏，将复苏后的菌液涂到含有氯霉素抗性的RCM培养基固体平板上培养，统计菌落生长情况。本发明专利技术对巴氏梭菌采用一种新型的转化体系，在遗传载体电击转化之前先进行超声处理，对穿梭载体质粒进行甲基化处理，获得的转化效率远远高于单独超声或单独电击处理的转化效率，开拓了外源基因转入巴氏梭菌的新途径，本发明专利技术方法简单，可操作性强，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，具体地说，是一种新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法。

技术介绍

1、巴氏梭菌（ clostridium pasteurianum，dsm 525）是由法国科学家louis pasteur在19世纪70年代早期首次发现的，其最初发现及命名就是因为它能够通过代谢产生丁酸，所以丁酸发酵是巴氏梭菌的主要代谢途径之一。另外，巴氏梭菌在发酵过程中能产生大量的氢气，这一特点使得巴氏梭菌在生物制氢研究中存在潜力，有助于开发生物能源领域的新技术。生物能源清洁高效，有助于缓解能源危机和减排温室气体。要进一步挖掘梭菌的生物生产潜力，尤其在提高生物能源方面，就必须依赖于菌株改良技术。

2、由于巴氏梭菌具有较厚的细胞壁，细胞壁上存在大量非特异性核酸酶，阻碍了外源基因的进入。其存在ⅱ型rm系统，该系统包括1个单独的甲基转移酶和1个内切酶，可以识别和消化特定序列的外源dna，严重影响了外源基因在梭菌中的稳定性。又因其严格厌氧、容易形成孢子等特点使得对其进行遗传转化操作变得十分困难，因此，急需找到一种可靠且本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中所述巴氏梭菌种子液的制备方法为：将冷冻保存的野生型巴氏梭菌接种至2×YTG培养基中，37℃静置培养12-14 h，使得菌液OD600值为0.8-1。

3.根据权利要求1或2所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，所述的2×YTG培养基成分为：16 g/L 蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，5 g/L 葡萄糖，0.2g/L半胱氨酸。

4.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传...

【技术特征摘要】

1.一种新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中所述巴氏梭菌种子液的制备方法为：将冷冻保存的野生型巴氏梭菌接种至2×ytg培养基中，37℃静置培养12-14 h，使得菌液od600值为0.8-1。

3.根据权利要求1或2所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，所述的2×ytg培养基成分为：16 g/l 蛋白胨，10 g/l酵母提取物，5 g/l nacl，5 g/l 葡萄糖，0.2g/l半胱氨酸。

4.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）中所述甘氨酸的添加量为12.5 g/l。

5.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）中所述冷冻离心条件为：4℃、8500 g离心10 min。

6.根据权利要求1所述的新型高效的巴氏梭菌遗传转化方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：范永强，徐大可，贺佳杰，李中，
申请(专利权)人：东北大学，
类型：发明
国别省市：