【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物信息领域，具体涉及e-guideseq：基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法。
技术介绍
1、在当前基因编辑疗法与细胞疗法迅速发展的背景下，crispr-cas9系统以其高效、简便的特点成为研究和临床应用的宠儿，crispr-cas9系统能够对生物体基因组的特定位点进行精确修饰，为遗传性疾病的治疗开辟了全新的前景。然而，随着其在基因治疗中的应用日益广泛，crispr-cas9系统的脱靶效应(即非目标位点的意外编辑)成为了一个不容忽视的问题。脱靶效应可能导致非预期的基因突变，进而影响细胞功能甚至引发疾病，因此，系统性地评估基因编辑系统中的脱靶效应，是确保其在临床应用中实现安全性和有效性的核心步骤，也是提升其成功率的关键保障。
2、guide-seq(genome-wide,unbiased identification of dsbs enabled bysequencing)是一种广泛使用的crispr-cas脱靶位点检测技术，它通过在基因编辑过程中引入特定的标记，利用这些标记来扩增和测序基因组断裂位点两侧的序列，从而鉴定出脱靶位点。这一技术的原理基于crispr-cas9系统在目标位点造成双链dna断裂(dsb)，并在修复过程中将长度不等的标记序列(dsodn)整合入基因组(参见tsai,s.q.et al."guide-seqenables genome-wide profiling of off-target cleavage by crispr
3、尽管guide-seq技术在识别crispr-cas9系统的脱靶效应方面取得了重要进展，但它在实际应用中仍面临灵敏度低的挑战。在某些情况下，由于脱靶事件的稀有性或标记效率不足，可能导致脱靶位点的漏检。而guide-seq的核心在于检测在dna双链断裂(dsb)发生后，dsodn在该区域的整合事件。因此整合位点的检测灵敏度决定了guide-seq的检测灵敏度。
4、其次，guide-seq主要针对单个靶点的编辑进行分析，而在多靶点同时编辑的情况下，该技术难以区分不同靶点的脱靶事件，这对于理解多靶点同时进行复杂基因编辑过程中的脱靶模式构成了挑战。
5、最后，guide-seq提供的临床有用信息相对有限，如缺乏对在靶编辑中编辑框的大小、脱靶编辑时，sgrna序列上非保守位点的识别，编辑位点的可视化展示，以及脱靶编辑位点是否在不良事件相关基因上等信息，对于编辑突变安全性评估而言，这些信息对于临床决策和治疗效果评估具有重要价值，但当前的guide-seq技术未能充分提供。
6、guideseq目前存在(1)脱靶位点检测的灵敏度低的问题；(2)仅仅适用于对单个靶点的脱靶检测，在多个靶点对细胞同时进行编辑时，无法确定脱靶是由于哪个靶点引起的；(3)无法提供对对编辑框的大小、编辑位点非保守位点的识别，也无法提供对脱靶编辑位点是否在基因特殊功能区域，或者不良事件相关基因上等信息，缺乏临床指导意义。
7、针对脱靶位点检测在实际应用中存在的上述问题，我们开发了e-guideseq(enhanced genome-wide,unbiased identification of dsbs enabled by sequencing)多靶点脱靶检测工具箱。e-guideseq方法通过从实验操作与生物信息学算法两个层面针对上述问题做了进一步优化，增加了基于二代测序的脱靶位点检测在crispr-cas9系统在医学领域的实用性。
技术实现思路
1、本专利技术首先提供了一种e-guide-seq方法，所述方法是基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法。
2、本专利技术还提供了一种e-guide-seq方法，所述方法是在guide-seq方法的基础上，使用s-epts/lm-pcr替换pcr。
3、在某些实施例中，所述方法包含以下步骤：
4、(1)目的基因组dna片段化，再纯化，得到纯化后的片段；
5、(2)将所述纯化后的片段进行引物延伸，捕获，再连接接头，得到带接头的目标产物；
6、(3)对所述带接头的目标产物进行巢式pcr，得到巢式pcr产物。
7、在某些实施例中，所述方法还包含巢式pcr产物的纯化、质控。
8、在某些实施例中，所述片段化为使用超声波打断。
9、在某些实施例中，所述延伸使用特异性生物素修饰引物。
10、在某些实施例中，所述捕获为链霉亲和磁珠捕获。
11、在某些实施例中，所述巢式pcr包含第一次巢式pcr和第二次巢式pcr。
12、在某些实施例中，所述方法还包含上级测序。
13、在某些实施例中，所述方法还包含对测序结果进行生信分析。
14、本专利技术与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
15、1)针对现有guide-seq技术灵敏度不足的问题，我们通过引入s-epts-pcr技术，优化了pcr扩增条件，显著提高了对低频脱靶事件的检测能力，达到了增强检测灵敏度的效果。
16、2)针对guide-seq技术在多靶点编辑时无法区分脱靶来源的限制，我们通过开发先进的生物信息学算法，实现了对多个靶点脱靶事件的准确区分和归因，达到了深入理解脱靶机制的效果。
17、3)针对guide-seq技术提供临床有用信息不足的问题，我们通过综合分析工具的开发，提供了编辑框大小、可视化展示以及脱靶位点是否在癌相关基因上等详细信息，达到了显著提升临床应用价值的效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.基于S-EPTS/LM-PCR的检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法是基于S-EPTS/LM-PCR的检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的方法。
2.基于S-EPTS/LM-PCR的检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法是在GUIDE-seq方法的基础上，使用S-EPTS/LM-PCR替换PCR。
3.基于S-EPTS/LM-PCR的检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包含巢式PCR产物的纯化、质控。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述片段化为使用超声波打断。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述延伸使用特异性生物素修饰引物。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述捕获为链霉亲和磁珠捕获。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述巢式PCR包含第一次巢式PCR和第二次巢
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包含上级测序。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包含对测序结果进行生信分析。
...【技术特征摘要】
1.基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法是基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法。
2.基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法是在guide-seq方法的基础上，使用s-epts/lm-pcr替换pcr。
3.基于s-epts/lm-pcr的检测crispr-cas9基因编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪帅，朱凤娇，阚科佳，王玉珏，李瑞，黄梓熙，姜运平，高三明，侯宇宸，王威，何峰，吴宁，
申请(专利权)人：上海唯可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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