一种NK细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增的培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增的培养方法，利用电刺激法促使NK细胞产生大量外泌体后，经过滤、超滤以及特异性免疫磁珠提取、纯化NK细胞外泌体，利用Western Blot、BCA法、DLS和NTA技术手段针对外泌体建立了一套严格的检测和定量标准，采用密度梯度离心法得到原代PBMC，在PBMC的活化和扩增阶段向细胞培养基中动态添加高活性、高纯度的NK细胞外泌体，实现了NK细胞的自我激活，显著提升了NK细胞增殖效率，同时降低了培养体系的安全性风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养，具体涉及一种nk细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增的培养方法。

技术介绍

0、技术背景

1、nk细胞（自然杀伤细胞）是一种重要的先天性免疫细胞，在抗肿瘤、抗病毒感染以及免疫调节中起着关键作用。其主要分布于脐血、外周血和骨髓中，但体内来源的nk细胞含量低、提纯难度高，无法满足研究及临床治疗需求。目前获得nk细胞的主要手段为体外扩增培养，其中，较为常用的体外扩增方法依赖于经基因修饰改造的k562细胞系或其他异源细胞系的刺激，利用细胞膜表面的刺激因子实现nk细胞的激活与增殖，但这种方法制备流程复杂、生产成本高、难度大，且存在潜在的免疫排斥和肿瘤发生风险。另一种广泛使用的纯因子培养技术，借助il-2、il-15、cd16单抗等细胞因子进行nk细胞体外扩增，虽一定程度上避免了异源细胞系的风险，但其对nk细胞的增殖刺激能力有限，难以突破增殖瓶颈。

2、因此，获得纯度高、扩增效率高、细胞毒性强的nk细胞已成为目前亟需解决的难题。

技术实现思路

1、针对上述难题，本专利技术提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种NK细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种NK细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，步骤1中所述提取、纯化NK细胞外泌体的具体步骤如下：

3.根据权利要求1所述的一种NK细胞外泌体激活NK细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，步骤3中所述外周血分离自体血浆和PBMC的具体步骤如下：取Ficoll淋巴细胞分离液和人外周血混合、离心得到淡黄色透明血浆和白膜层，透明血浆灭活、离心，取上清得到热灭活的自体血浆，向白膜层加入PBS，混匀、离心、弃上清，得到PBMC。</p>

4. 根...

【技术特征摘要】

1.一种nk细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种nk细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，步骤1中所述提取、纯化nk细胞外泌体的具体步骤如下：

3.根据权利要求1所述的一种nk细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，步骤3中所述外周血分离自体血浆和pbmc的具体步骤如下：取ficoll淋巴细胞分离液和人外周血混合、离心得到淡黄色透明血浆和白膜层，透明血浆灭活、离心，取上清得到热灭活的自体血浆，向白膜层加入pbs，混匀、离心、弃上清，得到pbmc。

4. 根据权利要求1所述的一种nk细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增的培养方法，其特征在于，步骤2中所述鉴定、检测利用western blot、bca法、dls和nta技术，所述westernblot检测的蛋白为alix、cd63、cd9和cd81，步骤3所述完全培养基中nk细胞外泌体浓度为0.5-2×108 particles/ml，完全培养基和自体血浆体积比为10：1，于细胞培养箱中活化孵育7天，每2天换完全培养基和自体血浆1次；步骤4中所述扩增培养基中nk细胞外泌体浓度为1-5×108 particles/ml，扩增培养基和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，黄智斌，邓洁，安果，徐阳，
申请(专利权)人：成都安缇赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：