【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及复制型逆转录病毒的检测。
技术介绍
1、随着病毒分子生物学，结构生物学的发展，人们对病毒的更深入的认识为基因治疗提供了稳定的理论基础，并且促成了病毒载体在临床研究中的广泛应用。γ-逆转录病毒载体是第一个进入临床研究的病毒载体，对病毒载体在基因治疗的应用的可行性及安全性进行了评估。截至2012年，仍有2/3的临床试验用到了病毒载体，其中逆转录病毒载体占到了19.7％。其中，γ-逆转录病毒载体是一类rna病毒，其中的许多野生型病毒都具有致病性，如murine leukaemia virus和feline leukaemia virus等，因此对在基因治疗产品中使用的病毒载体的安全性应当进行评估。
2、一个重要的考虑是由于逆转录病毒可将外源基因整合进入细胞基因组中，可能引起插入突变(insertional mutagenesis)，使得细胞基因序列发生改变并长期影响细胞基因表达，如整合位点位于原癌基因附近的细胞基因表达的上调可以改变细胞生长，影响宿主细胞基因型和表型的改变和导致内源性病毒的激活。在基因治疗重症免疫系统缺陷综合征scid-x1中，有报道逆转录病毒载体基因整合至lmo2原癌基因启动子附近导致lmo2表达紊乱和细胞不受控制的增殖，并且这些整合是非随机的；在基因治疗x染色体连锁慢性肉芽肿x-cgd中部分病人发生了白血病或骨髓增生异常，这些事件促使了更安全的逆转录病毒载体设计的发展，如自失活γ逆转录病毒载体sin-γrv的设计。但复制缺陷型自失活逆转录病毒载体含有病毒感染和运送基因
3、由于使用γ-逆转录病毒载体进行临床试验的增多，欧洲药品管理局ema于2003年欧盟委员会指令2003/63/ec对病毒安全性进行了要求，包括安全性评估，要求患者样本及最终药品具有可追溯性，非复制型病毒液中不含可复制型病毒，监控患者在接收治疗的全程及之后出现的可能感染及相关的后遗症，监控与患者频繁接触者如医护人员。2006年美国食品与药品监管局fda发布了对基于逆转录病毒载体的基因治疗产品rcr检测的指导意见，文件详细地推荐了相关检测方法，生产过程需要检测rcr的内容及检验量，并在2018年发布了新的指导文件草案，仍对rcr检测有明确的要求。我国国家食品药品监督管理总局cfda在2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》(试行)，对于采用基因修饰的细胞治疗产品，要求关注有复制能力的病毒产生(replication-competent viruses，rcv)和插入突变，特别是致癌基因的活化。在其生产质量评估阶段可对rcv形成风险进行评估，并应对其导致的插入突变风险进行评价，相关法律法规及指导性文件正在逐步完善。综合考虑相关法律法规及指导文件的要求，我们主要参考fda发布的相关指导文件进行rcr检测方法的开发与方法验证。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物与seq id no:1具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，所述引物组的反向引物与seq id no:2具有至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
2、在一个或多个实施方案中，所述引物组的正向引物与seq id no:1具有或约90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性；所述引物组的反向引物与seq id no:2具有或约91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性。
3、在一个或多个实施方案中，所述引物组还包括探针，所述探针与seq id no:3具有不低于85％的同一性。在一个或多个实施方案中，所述探针与seq id no:3具有或约有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
4、本专利技术还提供如上任一实施方案所述的引物组在制备检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的试剂中的应用。
5、在一个或多个实施方案中，所述检测基于聚合酶链反应(pcr)的方法。在一个或多个实施方案中，所述pcr的方法选自普通pcr(一代pcr)、实时荧光定量pcr(quantitativereal-time pcr,qpcr)、实时荧光定量逆转录pcr(real-time rt-pcr,rt-qpcr)和数字pcr(digital pcr,dig-pcr,dpcr)。在一个或多个实施方案中，所述实时荧光定量pcr为嵌合荧光染料法或荧光探针法。在一个或多个实施方案中，所述荧光染料法采用的是饱和荧光染料或非饱和荧光染料。在一个或多个实施方案中，所述荧光染料法采用的荧光染料是sybrgreenⅰ、eva green、lc green或pico green等。在一个或多个实施方案中，所述荧光探针法选自taqman探针法、分子信标探针法、mgb探针法和lightcycler探针法。
6、在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒。在一个或多个实施方案中，所述γ-逆转录病毒含有galv包膜。在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒是以长臂类人猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus，galv)包膜蛋白为包膜的γ-逆转录病毒。
7、在一个或多个实施方案中，所述样品是基因组dna或cdna。在一个或多个实施方案中，所述样品是cdna。在一个或多个实施方案中，所述基因组dna或cdna来自于所述逆转录病毒的宿主细胞，所述宿主细胞可生产所述逆转录病毒。在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒的宿主细胞为hek293细胞。
8、本专利技术还提供一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的试剂盒，所述试剂盒包含如上任一实施方案所述的引物组。
9、在一个或多个实施方案中，所述引物组单独地或混合地储存于容器(例如ep管)中。
10、在一个或多个实施方案中，所述引物组中的引物是固态或液态的。
11、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含pcr反应体系的常规成分。在一个或多个实施方案中，所述pcr反应体系的常规成分选自dntps、pcr反应缓冲液和dna聚合酶。在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含用于qpcr的荧光探针，在某些实施方案中，所述荧光探针法选自taqman探针、分子信标探针、mgb探针和lightcycler探针。
12、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含逆转录病毒宿主细胞(可生产所述病毒的细胞)，在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒宿主细胞为hek293细胞。
13、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含目的基因或片段的拷贝数或浓度已知的标准品。...
【技术保护点】
1.一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物与SEQ ID NO:1具有不低于90％的同一性，所述引物组的反向引物与SEQ IDNO:2具有不低于90％的同一性。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物与SEQ ID NO:1具有或约有90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性，所述引物组的反向引物与SEQ IDNO:2具有或约有91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性；或所述引物组还包括探针，所述探针与SEQ ID NO:3具有不低于85％的同一性，优选地，所述探针与SEQ ID NO:3具有或约有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测样品中是否存在逆转录病毒的试剂中的应用，所述逆转录病毒含有GaLV包膜或是以长臂类人猿白血病病毒(Gibbon Ape LeukemiaVirus，GALV)包膜蛋白为包膜的γ-逆转录病毒。
4.一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的试剂
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含qPCR反应体系的常规成分，如dNTPs、PCR反应缓冲液或DNA聚合酶。
6.一种检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的方法，其特征在于，所述方法使用了如权利要求1或2所述的引物组。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是基于聚合酶链反应(PCR)的方法；优选地，所述PCR的方法选自普通PCR(一代PCR)、实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR,qPCR)、实时荧光定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR,RT-qPCR)和数字PCR(Digital PCR,Dig-PCR,dPCR)；更优选地，所述PCR的方法为实时荧光定量PCR。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR为嵌合荧光染料法或荧光探针法；优选地，所述荧光探针法选自TaqMan探针法、分子信标探针法、MGB探针法和LightCycler探针法。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒，优选地，所述γ-逆转录病毒含有GaLV包膜或是以长臂类人猿白血病病毒(Gibbon ApeLeukemia Virus，GALV)包膜蛋白为包膜的γ-逆转录病毒。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品为免疫细胞治疗产品，所述免疫细胞治疗产品在制备或生产过程中使用或接触过含有GaLV包膜的γ-逆转录病毒；优选地，所述免疫细胞治疗产品为CAR-T、TCR-T、CAR-NK、CAR-NKT或CAR-M产品。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物与seq id no:1具有不低于90％的同一性，所述引物组的反向引物与seq idno:2具有不低于90％的同一性。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物与seq id no:1具有或约有90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性，所述引物组的反向引物与seq idno:2具有或约有91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性；或所述引物组还包括探针，所述探针与seq id no:3具有不低于85％的同一性，优选地，所述探针与seq id no:3具有或约有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测样品中是否存在逆转录病毒的试剂中的应用，所述逆转录病毒含有galv包膜或是以长臂类人猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus，galv)包膜蛋白为包膜的γ-逆转录病毒。
4.一种用于检测样品中是否存在复制型逆转录病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含qpcr反应体系的常规成分，如dntps、pcr反应缓冲液或dna聚合酶。
6.一种检测样品中是否存在复...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳梅，魏洁琼，赵威，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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