CRISPR-免疫联合小分子检测探针制备及检测方法技术

本发明专利技术具体涉及了一种CRISPR‑免疫联合小分子检测探针制备及其相关检测方法和用途。探针制备主要采用一种化学生物偶联方法，用双功能交联剂4‑（N‑马来酰亚胺甲基）环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo‑SMCC）和N‑琥珀酰亚胺基‑S‑乙酰硫基乙酸酯（SATA），将5’端修饰‑NH<subgt;2</subgt;的dsDNA和单克隆抗体共价偶联制备成dsDNA‑抗体探针。其次，本检测方法以dsDNA‑抗体探针作为桥梁将免疫系统和CRISPR/Cas12a系统结合，利用抗体对小分子的特异性识别能力，并借助RPA核酸扩增进行信号放大及CRISPR/Cas12a的顺式切割活性和/或反式单链DNA切割活性产生荧光信号，实现免疫反应信号向高强度荧光信号的转变，建立了CRISPR‑免疫联合小分子检测体系。所述检测方法操作简单、特异性强、灵敏度极高且信号稳定等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体涉及了一种crispr-免疫联合小分子检测探针制备方法及其相关检测方法和用途。

技术介绍

1、近年来，crispr系统的发现研究为核酸靶标的检测提供全新的方法，而利用crispr系统对非核酸靶标（如小分子物质）的工作十分有限。然而，在医药、环境和食品安全等领域对小分子标记物或污染物的检测十分重视，如β-激动剂就是一类具有代表性的小分子污染物，常被非法用于动物养殖，能引起人体急性中毒或慢性蓄积性中毒，并给生物链和环境带来长期的难以估计的影响。尽管危害严重，但现阶段针对如β -激动剂这类禁用的小分子污染物检测方法中，仪器分析法已非常成熟，但是该方法弊端在于样品预处理复杂，依赖昂贵的仪器和专业的技术人员；生物传感器法不稳定的特性造成了方法难以用于实际应用；免疫分析法优势在于操作简便，耗时短，同时拥有良好的稳定性，但该方法的缺点主要在于灵敏度更多依赖抗体本身的性质，对于法律规定禁止检出的β-激动剂来说检测性能不够。结合免疫分析法的特异性、可调控性以及crispr/cas系统的超高灵敏度和信号稳定性，建立crispr-免疫联合检测体系本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种dsDNA-抗体探针，包括抗体和靶标dsDNA，其特征在于：所述抗体为任意单克隆抗体，所述dsDNA为长度100-300bp的、且序列中含有PAM位点“TTTV”的靶标dsDNA，两者经马来酰亚胺-巯基偶联方法合成dsDNA-抗体探针，其中靶标dsDNA序列由四部分组成，包括：与抗体进行连接的长度为5-10bp的连接臂、序列中含有PAM位点“TTTV”和与crRNA互补的靶标序列、提供给Cas12a酶/crRNA复合物足够结合空间以及RPA引物识别序列。

2.根据权利要求1所述的dsDNA-抗体探针,其特征在于，所述dsDNA长度为219bp。p>

3.根据权...

【技术特征摘要】

1.一种dsdna-抗体探针，包括抗体和靶标dsdna，其特征在于：所述抗体为任意单克隆抗体，所述dsdna为长度100-300bp的、且序列中含有pam位点“tttv”的靶标dsdna，两者经马来酰亚胺-巯基偶联方法合成dsdna-抗体探针，其中靶标dsdna序列由四部分组成，包括：与抗体进行连接的长度为5-10bp的连接臂、序列中含有pam位点“tttv”和与crrna互补的靶标序列、提供给cas12a酶/crrna复合物足够结合空间以及rpa引物识别序列。

2.根据权利要求1所述的dsdna-抗体探针,其特征在于，所述dsdna长度为219bp。

3.根据权利要求1或2所述的dsdna-抗体探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的dsdna-抗体探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）、步骤（3）及步骤（6）的浓缩除杂过程包括：将超滤管在6000 r/min，4℃的条件下离心，每离心10分钟取出超滤管，用移液枪将液体打在两边膜上，反复吹吸3-5次。

5.根据权利要求4所述的dsdna-抗体探针的制备方法，其特征在于，所述盐酸羟胺溶液包括以下制备步骤：

6.根据权利要求5所述的dsdna-抗体探针的制备方法，其特征在于，所述抗体为沙丁胺醇单克隆抗体，所述dsdna为长度为219bp的双链dna。

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【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴，黄颖茵，郑佳乐，雷红涛，赵岗，李向梅，徐振林，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：