【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及经修饰的dda解旋酶，其可用于控制分析物诸如多核苷酸的移动。经修饰的dda解旋酶用于分析物检测和表征。本专利技术还涉及新颖的蛋白孔或孔复合体及其在分析物检测和表征中的用途。
技术介绍
1、使用纳米孔感测进行分析物(尤其是聚合物)表征的基本组分中的两者是(1)控制聚合物移动通过孔，以及(2)在聚合物移动通过孔时区分组成构建块。在纳米孔感测期间，相对于作为分析物相对于纳米孔移动的函数的测量信号的变化，孔的最窄部分通常对应于纳米孔的最具辨别力的部分。csgg被鉴定为来自大肠杆菌的非门控、非选择性蛋白质分泌通道(goyal等人,2014)，并已被用作检测和表征分析物的纳米孔。还公开了在这种情况下改善孔的特性的野生型csgg孔的突变(wo2016/034591、wo2017/149316、wo2017/149317、wo2017/149318、wo2018/211241和wo2019/002893，其通过引用以其整体并入本文)。wo2015/055981、wo2015/166276和wo2016/055777描述了多核苷酸结合蛋白，...
【技术保护点】
1.一种经修饰的DNA依赖性ATP酶(Dda)解旋酶，其中所述解旋酶在对应于Dda1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的位置中的一个或多个处包含修饰或取代。
2.根据权利要求1所述的经修饰的DNA依赖性ATP酶(Dda)解旋酶，其中(a)对应于位置55的氨基酸被D、E、K、N或S取代，(b)对应于位置114的氨基酸被A、V、I、L、M、F、Y、W、G、P、S、T、N或Q取代，(c)对应于位置156的氨基酸被A、E、F、G、I、L、M、P、S、V、Y、D、K或N取代，(d)对应于位置177的氨基酸被D、E、F、G...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中所述解旋酶在对应于dda1993中的氨基酸位置55、114、156、177、210、221、350和358的位置中的一个或多个处包含修饰或取代。
2.根据权利要求1所述的经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中(a)对应于位置55的氨基酸被d、e、k、n或s取代，(b)对应于位置114的氨基酸被a、v、i、l、m、f、y、w、g、p、s、t、n或q取代，(c)对应于位置156的氨基酸被a、e、f、g、i、l、m、p、s、v、y、d、k或n取代，(d)对应于位置177的氨基酸被d、e、f、g、h、i、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y取代，(e)对应于位置210的氨基酸被d、e、k、s、n、r、h或y取代，(f)位置221处的氨基酸被d、k、e、q、r、a、h、l、t或y取代，(g)对应于位置350的氨基酸被a、d、e、g、k、l、n、q、r、t、v、h或m取代，或被d、e、a、v、i、l、m、f、w、r、h、k、l、s、t、n或q取代，以及/或者(h)对应于位置358的氨基酸被d、e、a、v、i、l、m、f、y、w、r、h、l、s、t、n或q取代。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的dda解旋酶，其中所述解旋酶在对应于dda1993中的氨基酸位置40的位置处进一步包含修饰或取代。
4.根据权利要求3所述的经修饰的dna依赖性atp酶(dda)解旋酶，其中对应于位置40的氨基酸被a、v、i、l、m、f、y或w取代。
5.一种构建体，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶和另外的多核苷酸结合部分，其中所述解旋酶附接至所述多核苷酸结合部分，并且所述构建体具有控制分析物的移动的能力。
6.根据权利要求5所述的构建体，其中所述构建体包含两种或更多种根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶。
7.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体的序列。
8.一种载体，所述载体包含根据权利要求7所述的多核苷酸，其可操作地连接至启动子。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的载体。
10.一种制备根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体的方法，所述方法包括：表达根据权利要求7所述的多核苷酸，用根据权利要求8所述的载体转染细胞，或培养根据权利要求9所述的宿主细胞。
11.一种控制分析物的移动的方法，所述方法包括使所述分析物与根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体接触，并由此控制所述分析物的所述移动。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法用于控制分析物通过跨膜孔的所述移动。
13.一种表征目标分析物的方法，所述方法包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述目标分析物的长度，(ii)所述目标分析物的身份，(iii)所述目标分析物的序列，(iv)所述目标分析物的二级结构以及(v)所述目标分析物是否被修饰。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述目标分析物通过甲基化、氧化、损伤、用一种或多种蛋白质、或用一种或多种标记、标签或间隔基进行修饰。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中通过电测量和/或光学测量来测量所述目标分析物的所述一个或多个特征。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述电测量是电流测量、阻抗测量、隧穿测量或场效应晶体管(fet)测量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法包括：
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括跨所述孔施加电压以在所述孔与所述解旋酶或构建体之间形成复合体的步骤。
20.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少一部分是双链的。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述孔是跨膜蛋白孔或固态孔。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔源自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)、mspb、mspc、mspd、胞溶素、外膜孔蛋白f(ompf)、外膜孔蛋白g(ompg)、外膜磷脂酶a、奈瑟菌自转运脂蛋白(nalp)和wza、csgg、csgg/csgf、胞溶素、clya、sp1或溶血蛋白fragaceatoxin c(frac)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中跨膜蛋白由六至十个如seq id no:3所示的相同亚基或(b)其变体形成，其中所述亚基中的一个或多个在整个序列上与seq id no:3具有至少40％同一性，并且其具有孔活性。
24.一种形成用于表征目标分析物的传感器的方法，所述方法包括在(a)孔与(b)根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体之间形成复合体，并由此形成用于表征所述目标分析物的传感器。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述复合体通过以下来形成：(a)在所述目标分析物存在下使所述孔与所述解旋酶或构建体接触，以及(a)跨所述孔施加电势。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述电势是电压电势或化学势。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述复合体是通过将所述孔共价附接至所述解旋酶或构建体而形成的。
28.一种用于表征目标分析物的传感器，所述传感器包含(a)孔与(b)根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体之间的复合体。
29.根据权利要求1至4中任一项所述的解旋酶或根据权利要求5或6所述的构建体用于控制目标分析物通过孔的移动的用途。
30.一种用于表征目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括
31.一种用于表征样品中的目标分析物的设备，所述设备包括(a)多个孔以及(b)多种根据权利要求1至4...
【专利技术属性】
技术研发人员：瑞贝卡·维多利亚·鲍恩，马克·约翰·布鲁斯，伊丽莎白·杰恩·华莱士，保罗·理查德·穆迪，弗朗西斯·布尔萨，大卫·克里斯托夫·佩奇，马吉德·莫萨耶比，安德鲁·约翰·赫伦，阿尔贝托·列拉，克里斯多夫·彼得·约德，理查德·查尔斯·福斯特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：
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