【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器，涉及一种利用纳米酶促电活性分子二茂铁-酪胺沉积反应放大检测信号的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肝细胞癌的死亡率几乎和发病率持平，是影响人类健康的最大威胁之一，肝细胞癌危险因素多，早期症状隐匿，预后差等原因使其患者发病率逐年增加。因此，探索灵敏、快速、特异的新型肝癌标志物和检测工具对肝细胞癌的早期监测和诊断尤其重要。衰老标记蛋白-30(smp30)，又称调节钙蛋白，主要以正常人肝细胞和肾小管上皮细胞中表达为主，而在hcc组织中smp30的表达量低于hcc癌旁组织。虽然，传统的肿瘤标志物是由癌细胞直接产生的，但肿瘤能够诱导机体发生免疫反应，产生抗肿瘤相关抗原的自身抗体，该抗体表达水平同肿瘤发展密切相关，能够在肿瘤相关抗原浓度低的情况下作为肿瘤的诊断标志物相关研究表明，smp30抗体在afp阴性的早期肝癌中有显著的阳性表达，因此，smp30抗体被认为是肝细胞癌的一个有吸引力的新型靶点，可作为追踪、诊断早期肝癌的可靠肿瘤标志物。
2、纳米酶是指尺寸在纳米结构范围，由单组分的纳米材料制备的人造酶。它表现出类似天然酶的催化性能和其独特的稳定性，同时还能够根据使用条件对其表面结构进行修改。在过去的几十年，已有各种类型纳米酶被设计，根据其组分和催化活性机制，主要分为金属粒子纳米酶、金属化合物纳米酶、非金属纳米酶和其它类型：(i)金、银、铂和钯等金属纳米粒子组成的纳米酶，这类纳米酶对非均相反应表现出良好的催化性能，在不做任何修饰的情况下表现出超高的类过氧化物酶活性。其催化过程与ph、底物
3、用于检测肿瘤标志物的生物传感器因其结果可靠、分析速度快而被广泛应用于分子诊断。然而，大多数肿瘤标志物为惰性的蛋白质分子，在检测过程中很难被直接检测。酶通常被标记在识别探针上作为酶催化信号放大的外源信号分子，在三明治型生物传感系统中起到关键作用。二茂铁(fc)是一种由两个环戊二烯基环连接中心铁原子构成的有机过渡金属化合物，具有可逆的氧化还原状态和较高的电化学活性，是一种理想的电信号分子。因此，为了进一步提高分析目标分子的传感器性能，基于fc及其衍生物的电活性分子被广泛用于电子传递介质的生物传感器构建中。近年来，基于酶催化信号放大技术，已有大量报道用于超灵敏痕量分析的生物传感器。酪胺信号放大(tsa)是早期通过原位扩增来增强荧光免疫组化分析的技术。目前，其原位扩增的特点被广泛应用到传感器策略中，其反应原理中酶在h2o2存在下催化酪胺形成共价结合位点，新加入的酪胺及其复合物可短时间内与之稳定结合，促使原始信号几何放大。
4、目前尚未有合成了一种新型二茂铁基的电活性物质二茂铁酪作为电活性探针开发了一个用于特异性检测肝癌标志物gpc3的生物传感分析平台的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术目的是，针对上述问题，提供了一种利用纳米酶促电活性分子二茂铁-酪胺沉积反应放大检测信号的电化学免疫传感器及其制备方法和应用，以首先以鼠源单克隆抗体为分析物，基于96孔板的独立免疫反应和纳米酶go-hemin催化二茂铁酪胺沉积反应，提出了一种用于检测肝癌肿瘤标志物smp30抗体的分体式生物传感器模型。并探究了其可行性，随后利用该传感器模型对smp30抗体进行定量分析。在靶标物质存在的情况下，纳米酶高效、稳定、快速的酶催化活性与氧化还原性能优异的二茂铁酪胺协同作用，使大量的电活性物质二茂铁酪胺沉积在电极表面，电流信号输出值发生显著改变。该分体式生物传感器特异、灵敏的分析性能实现了smp30抗体的快速检测，也为其它肿瘤标志物的传感分析提供新思路。
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、利用纳米酶促电活性分子二茂铁-酪胺沉积反应放大检测信号的电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器是基于96孔板和纳米酶催化电活性分子二茂铁-酪胺沉积信号放大的超灵敏分体式生物传感器，将电活性分子二茂铁-酪胺作为信号放大元件，标记于信号抗体，通过捕获抗体探针、目标抗原和信号抗体之间的夹心免疫反应，实现电流检测信号的显著放大和对目标抗原的灵敏检测。
4、本专利技术还提供一种入上述所述的电化学免疫传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
5、(1)制备免疫复合物go/hemin-ab2：
6、s1、将羧基化氧化石墨烯溶于超纯水中，超声分散，离心，取上清液，
7、s2、接着再将氯化血红素溶于二甲基甲酰胺中，与步骤s1得到的上清液混合，超声处理，再通过离心将沉淀物和上清液分离，pbs缓冲液洗涤2次，在烘箱中干燥得到go/hemin，然后，将得到的氯化血红素功能化的go/hemin分散到超纯水中，超声后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温下搅拌，再加入多克隆抗体，反应，然后离心分离上清和沉淀，用pbs洗涤，最后在真空干燥机中干燥后置于pbs溶液重悬，制备最终的免疫复合物go/hemin-ab2，备用；
8、(2)制备ge/au nps/mpa/tyr修饰的金电极：
9、1)用氧化铝匀浆抛光金电极，将打磨干净的金电极放入无水乙醇中超声清洗，接着在超纯水中超声清洗，如此交替超声，重复3次；
10、2)将三电极系统同时置于0.5m h2so4溶液中进行电化学清洗，采用电化学循环伏安法慢扫，再进行电解池充放电，将电解池接通，接着进行cv快扫，最后再次进行cv慢扫，以上操作重复两次，ddh2o洗涤三次；
11、3)将ge浸入haucl4溶液中，电沉积au nps，形成au nps修饰的ge/au nps，将ge/aunps在3-巯基丙酸中孵育过夜，得ge/au nps/mpa，将edc-nhs溶液滴在ge/au nps/mpa表面室温孵育，接着将tyr溶液滴加到ge/au nps/mpa表面，在室温下孵育，利用羧基与氨基的缩合反应，将酪胺固定在电极表面，用水冲洗后，获得au nps/mpa/tyr修饰的金电极(ge/aunps/mpa/tyr)；
12、(3)室温下孵育目标ag，以使ab1与ag发生特异性免疫反应；再滴加步骤(1)制备好的g本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用纳米酶促电活性分子二茂铁-酪胺沉积反应放大检测信号的电化学免疫传感器，其特征在于：所述电化学免疫传感器是基于96孔板和纳米酶催化电活性分子二茂铁-酪胺沉积信号放大的超灵敏分体式生物传感器，将电活性分子二茂铁-酪胺作为信号放大元件，标记于信号抗体，通过捕获抗体探针、目标抗原和信号抗体之间的夹心免疫反应，实现电流检测信号的显著放大和对目标抗原的灵敏检测。
2.一种如权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)制备免疫复合物GO/Hemin-Ab2：S1.将羧基化氧化石墨烯溶于超纯水中，超声分散，离心，取上清液，S2.接着再将氯化血红素溶于二甲基甲酰胺中，与步骤S1得到的上清液混合，超声处理，再通过离心将沉淀物和上清液分离，PBS缓冲液洗涤2次，在烘箱中干燥得到GO/Hemin，然后，将得到的氯化血红素功能化的GO/Hemin分散到超纯水中，超声后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌，再加入多克隆抗体，反应，然后离心分离上清和沉淀，用PBS洗涤，最后在真空干燥机中干燥后置于PBS溶液重悬，
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述羧基化氧化石墨烯与超纯水的比例为1mg：1mL，超声分散3h以上，3000rpm离心30min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述氯化血红素用量为26.076mg、二甲基甲酰胺用量为4mL，超声处理是室温条件下130KHz进行3h，再通过13000rpm离心30min将沉淀物和上清液分离；所述GO/Hemin与超纯水的比例为1mg：mL；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用量为500μL，室温下搅拌4h，再加入30μL浓度为1mg/mL的多克隆抗体，整个混合物体系在4℃下震荡反应24h，然后4℃、3000rpm离心30min分离上清和沉淀，用PBS洗涤2次，最后在真空干燥机中干燥12h后置于2mL0.01M的PBS溶液重悬，制备最终的免疫复合物GO/Hemin-Ab2，并在4℃下保存备用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述氧化铝匀浆的细度大小为0.3μm和/或0.05μm；所述超声清洗均为5min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述三电极系统包括金电极、铂丝对电极、Ag/AgCl参比电极。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述电化学循环伏安法慢扫的扫描范围为-0.25～1.5V，扫描速率为100mV/s；电解池接通的电压为2V，5s和-0.25V，10s；所述CV快扫的扫描范围为-0.25～1.5V，扫描速率为400mV/s。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，具体操作是将第一步中预处理好的金电极(GE)浸入HAuCl4溶液中，在-0.5V电势下电沉积AuNPs120s，形成AuNPs修饰的GE/AuNPs，并用水冲洗电极3次，将GE/AuNPs在300μL10mM3-巯基丙酸...
【技术特征摘要】
1.利用纳米酶促电活性分子二茂铁-酪胺沉积反应放大检测信号的电化学免疫传感器，其特征在于：所述电化学免疫传感器是基于96孔板和纳米酶催化电活性分子二茂铁-酪胺沉积信号放大的超灵敏分体式生物传感器，将电活性分子二茂铁-酪胺作为信号放大元件，标记于信号抗体，通过捕获抗体探针、目标抗原和信号抗体之间的夹心免疫反应，实现电流检测信号的显著放大和对目标抗原的灵敏检测。
2.一种如权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)制备免疫复合物go/hemin-ab2：s1.将羧基化氧化石墨烯溶于超纯水中，超声分散，离心，取上清液，s2.接着再将氯化血红素溶于二甲基甲酰胺中，与步骤s1得到的上清液混合，超声处理，再通过离心将沉淀物和上清液分离，pbs缓冲液洗涤2次，在烘箱中干燥得到go/hemin，然后，将得到的氯化血红素功能化的go/hemin分散到超纯水中，超声后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌，再加入多克隆抗体，反应，然后离心分离上清和沉淀，用pbs洗涤，最后在真空干燥机中干燥后置于pbs溶液重悬，制备最终的免疫复合物go/hemin-ab2，备用；(2)制备ge/aunps/mpa/tyr修饰的金电极：1)用氧化铝匀浆抛光金电极(ge)，将打磨干净的ge放入无水乙醇中超声清洗，接着在超纯水中超声清洗，如此交替超声，重复3次；2)将三电极系统同时置于0.5mh2so4溶液的电解槽中进行电化学清洗，采用电化学循环伏安法慢扫，再进行电解池充放电，将电解池接通，接着进行cv快扫，最后再次进行cv慢扫，以上操作重复两次，ddh2o洗涤三次；3)将在第一步中处理好的ge浸入haucl4溶液中，电沉积aunps，形成aunps修饰的ge/aunps，将ge/aunps在3-巯基丙酸中孵育过夜，得ge/aunps/mpa，将edc-nhs溶液滴在ge/aunps/mpa表面室温孵育，接着将tyr溶液滴加到ge/aunps/mpa表面，在室温下孵育，利用羧基与氨基的缩合反应，将酪胺固定在电极表面，用水冲洗后，获得aunps/mpa/tyr修饰的金电极(ge/aunps/mpa/tyr)；(3)室温下孵育目标ag，以使ab1与ag发生特异性免疫反应；再滴加步骤(1)制备好的go-hemin-ab2孵育1h，然后将14μl1mg.ml-1fc-tyr、14μl1mg.ml-1tyr、14μl50mmh2o2组合成的混合溶液继续滴入，同时将步骤(2)获得的ge/aunps/mpa/tyr也加入，在37℃中持续反应30min，即可得到所述的电化学免疫传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤s1中，所述羧基化氧化石墨烯与超纯水的比例为1mg：1ml，超声分散3h以上，...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，虞先濬，黄勇，钟莉娉，何坚，施思，徐近，王旭，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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