【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全检测，具体涉及一种基于abei/co2+/go@dna水凝胶的辉光型化学发光传感器及其应用。
技术介绍
1、鼠伤寒沙门氏菌，作为一种普遍存在的食源性病原体，严重威胁着公众健康，能够潜在地引发急性肠胃炎乃至败血症等严重疾病。鉴于此，实现对食品中该菌种的高效、精准且快速的检测显得尤为重要。尽管微生物培养法因其原理直观、技术成熟且检测准确性高，已被确立为我国国家标准中所规定使用的检测方法，但其显著的局限性在于检测周期冗长，通常需要3-5天才能完成，这明显滞后于现代食品安全管理中对食源性致病菌快速响应的需求。因此，探索并开发高灵敏度、高准确性且能在更短时间内完成检测的新技术，对于提升食品安全检测效率、保障公众健康具有迫切意义。
2、基于现有检测方法的局限性，化学发光生物传感器由于响应速度快、无需外部光源激发等优势在食源性致病菌检测领域备受关注。然而，大多数化学发光底物，如鲁米诺、吖啶酯等，均呈现闪光型化学发光，即发光和湮灭在几秒内完成，瞬时发光特性往往会导致较差的检测精度和重现性。
3、dna水凝胶是dna链在溶液中高度交联形成的三维网状结构。利用其致密的网状结构能够有效延缓化学发光反应物的扩散，进而延长化学发光时间，将闪光型化学发光转变为辉光型化学发光。目前，已有基于dna水凝胶的辉光型化学发光传感器的报道，然而，这些dna水凝胶多依赖于大量短dna链之间的碱基互补配对作用而形成。这种化学合成的dna需要高纯度的原材料和专业的仪器设备，由此导致的较高的dna合成成本限制了其在分析检测领域的
4、滚环扩增(rca)技术是一种等温核酸放大技术，凭借其dna序列设计的灵活性与反应条件的恒温性，已成为构建dna水凝胶的理想平台。该技术生成的ssdna链富含由rca模板互补序列串联而成的重复单元，赋予了dna水凝胶功能性和个性化定制潜力。根据检测对象的适配体序列，设计相应的引物和rca反应模板序列，利用适配体、引物和目标物之间的竞争性结合作用，可在目标物诱导下，生成dna水凝胶，辅以相应的检测信号输出，进而实现目标物的灵敏检测。然而，rca产物dna水凝胶的形成通常需要24～72h，较长的成胶时间为现场快速检测带来诸多不便，无法满足鼠伤寒沙门氏菌的现场快速检测。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于abei/co2+/go@dna水凝胶的辉光型化学发光传感器及其应用。本专利技术通过abei/co2+/go加速dna水凝胶的形成，进而利用dna水凝胶延缓反应物扩散以延长化学发光反应时间，制备了辉光型化学发光传感器，有效克服了闪光型化学发光的缺陷，为鼠伤寒沙门氏菌的现场快速检测提供诸多便利。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于abei/co2+/go@dna水凝胶的辉光型化学发光传感器，所述辉光型化学发光传感器包括适配体-引物复合物、环状的模板、二级引物、phi29 dna聚合酶、dntps、abei/co2+/go和目标物；
4、所述适配体-引物复合物中适配体序列如seq no.1所示，引物序列如seq no.2所示；
5、所述模板序列如seq no.3所示；
6、所述二级引物序列如seq no.4所示。
7、进一步地，所述abei/co2+/go的制备方法为：
8、(1)将abei溶液与go溶液混合，于25℃、1000rpm条件下避光震荡孵育12h，得到abei/go；
9、(2)然后加入氯化钴溶液，于25℃、1000rpm条件下避光震荡孵育3h，于12500rpm条件下离心20min、弃上清，经超纯水洗涤，复溶，得到abei/co2+/go。
10、进一步地，步骤(1)中，所述abei溶液的配置方法为：将27.633mg的abei溶解于10ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中；所述go溶液的配置方法为：将0.1mg go溶解于1ml纯水中，于400w超声处理1h；所述abei溶液与go溶液的体积比为0.1:1。
11、进一步地，步骤(2)中，所述氯化钴溶液的配置方法为：将237.9mg六水合氯化钴溶解并定容于100ml纯水中；所述氯化钴溶液与go溶液的体积比为0.25:1。
12、进一步地，所述适配体-引物复合物的制备方法为：
13、(1)将20μl 10μmol/l的适配体与20μl 10μmol/l引物于pcr管中混合均匀，置于pcr仪中，在95℃下退火10min，然后缓慢冷却以获得适配体-引物复合物；
14、(2)向其中加入14μl 5u/μl的核酸外切酶ⅰ以酶解未结合的dna单链，制备得到纯化后的适配体-引物复合物。
15、进一步地，所述环状的模板制备方法如下：
16、(1)将30μl 20μmol/l的成环引物与链状的模板混合均匀，采用梯度降温法进行杂交，得到模板的环状dna前体；
17、所述成环引物序列如seq no.5所示；
18、(2)再加入7.5μl 400u/μl的t4 dna连接酶，在37℃下孵育2h，并在65℃下孵育10min灭酶；然后依次加入10μl 5u/μl的exoⅰ酶、5μl 200u/μl的exoⅲ酶，先在37℃孵育1h，然后在80℃下孵育20min，得到纯化后的环状的模板。
19、一种所述辉光型化学发光传感器的应用，所述辉光型化学发光传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌。
20、进一步地，使用所述辉光型化学发光传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括如下步骤：
21、(1)制备abei/co2+/go@dna水凝胶；
22、(2)向abei/co2+/go@dna水凝胶中加入100μl 0.01mol/l的h2o2溶液中反应1min后，拍摄发光图像，并使用image j软件分析其rgb值，将rgb值代入标准曲线得到待测样品中目标物鼠伤寒沙门氏菌的浓度。
23、进一步地，步骤(1)中，所述abei/co2+/go@dna水凝胶的制备方法为：
24、(1)取54μl制备的适配体-引物复合物，加入246μl待测目标物，于37℃、600rpm条件下震荡孵育45min，使适配体识别并结合目标物，然后经0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，得到游离的引物；
25、(2)取30μl游离的引物，与15μl 3μmol/l二级引物、3μl环状模板、2.5μl 25mmol/l的dntps、1μl纯水、6μl 10×phi29 dna聚合酶反应缓冲液和2.5μl 10u/μl的phi29 dna聚合酶充分混合，于37℃，800rpm下孵育25min；然后加入15μl abei/co2+/go，于37℃，1050rpm下孵育10min，得到abei/co2+/go@dna水凝胶。
26、进一步地，所述标准曲线为：y＝49.24+1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于ABEI/Co2+/GO@DNA水凝胶的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述辉光型化学发光传感器包括适配体-引物复合物、环状的模板、二级引物、Phi29 DNA聚合酶、dNTPs、ABEI/Co2+/GO和目标物；
2.根据权利要求1所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述ABEI/Co2+/GO的制备方法为：
3.根据权利要求2所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，步骤(1)中，所述ABEI溶液的配置方法为：将27.633mg的ABEI溶解于10mL浓度为0.1mol/L的NaOH溶液中；所述GO溶液的配置方法为：将0.1mg GO溶解于1mL纯水中，于400W超声处理1h；所述ABEI溶液与GO溶液的体积比为0.1:1。
4.根据权利要求2所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，步骤(2)中，所述氯化钴溶液的配置方法为：将237.9mg六水合氯化钴溶解并定容于100mL纯水中；所述氯化钴溶液与GO溶液的体积比为0.25:1。
5.根据权利要求1所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述适配体-引物复合物的制
6.根据权利要求1所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述环状的模板制备方法如下：
7.一种权利要求1-6任一项所述辉光型化学发光传感器的应用，其特征在于，所述辉光型化学发光传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，使用所述辉光型化学发光传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述ABEI/Co2+/GO@DNA水凝胶的制备方法为：
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述标准曲线为：Y＝49.24+1.34*X，R2＝0.9942，其中Y表示RGB值，X表示鼠伤寒沙门氏菌的浓度的对数值。
...【技术特征摘要】
1.一种基于abei/co2+/go@dna水凝胶的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述辉光型化学发光传感器包括适配体-引物复合物、环状的模板、二级引物、phi29 dna聚合酶、dntps、abei/co2+/go和目标物；
2.根据权利要求1所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，所述abei/co2+/go的制备方法为：
3.根据权利要求2所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，步骤(1)中，所述abei溶液的配置方法为：将27.633mg的abei溶解于10ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中；所述go溶液的配置方法为：将0.1mg go溶解于1ml纯水中，于400w超声处理1h；所述abei溶液与go溶液的体积比为0.1:1。
4.根据权利要求2所述的辉光型化学发光传感器，其特征在于，步骤(2)中，所述氯化钴溶液的配置方法为：将237.9mg六水合氯化钴溶解并定容于10...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝丽玲，徐斐，李梦秋，叶泰，曹慧，袁敏，阴凤琴，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：
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