【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，涉及一种苯丙酮酸还原酶突变体，特别是一种高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体及其在催化生产苯乳酸中的应用。
技术介绍
1、苯乳酸(phenyllactic acid，pla)又称2-羟基-3-苯基丙酸，是一种天然小分子有机酸，化学式为c9h10o3，最早发现于发酵食品和蜂蜜中，高纯度时为白色结晶，有较好的水溶性，耐酸耐热，性质稳定。目前食品安全逐渐成为热门的话题，苯乳酸作为一种天然且安全的新型食品防腐剂受到广泛关注。苯乳酸主要是通过破坏细胞壁、细胞膜以及dna进而起到抑菌杀菌的作用，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌(如单增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌)以及真核微生物(如曲霉、青霉)等都有良好的抑制作用。苯乳酸还具有一定的药理功能，可以调节人体类固醇水平和抗血小板凝集。此外，苯乳酸也是一种良好的生物基材料，由其聚合而成的聚苯乳酸具有比聚乳酸更好的热稳定性以及紫外线吸收性能。综上所述，苯乳酸在医药、食品、材料领域都有良好的应用，因此苯乳酸的合成也成为了研究的热点。
2、苯丙酮酸还原酶能够催化前手性的苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，ppa)不对称还原生成苯乳酸，相较于化学合成以及生物发酵的方式，这种酶催化法生产苯乳酸具有条件温和、产率得率高、工艺简便、环境友好的特点。酮酸还原酶来源广泛，目前已在大肠杆菌、酿酒酵母、乳酸菌等微生物中筛选出了还原酶产生菌株。然而，大多数还原酶在野生型菌株中的表达量偏低，无法满足工业化生产的需求，小部分经过多轮诱变和筛选后表
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种苯丙酮酸还原酶突变体，这一发现对于工业化催化苯丙酮酸生产苯乳酸及苯丙酮酸还原酶的工业化应用有重要的现实意义。目前尚未有关于第193位点和203位点的研究，这两个位点位于酶表面，与nadh以及底物结合活性相关，本专利技术首次提出将这两个位点进行定点突变，并获得了酶活显著提高的突变体，为苯丙酮酸还原酶酶活提高的突变设计提供了更多可能性。
2、本专利技术通过定点突变的办法，对来源于lactobacillus sp.cgmcc 9967的野生型苯丙酮酸还原酶进行分子改造，获得高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
4、第一方面，本专利技术提供了一种高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体，将seq id no.1所示氨基酸序列的第193位由天冬酰胺突变为天冬氨酸，第203位由组氨酸突变为精氨酸。
5、第二方面，本专利技术提供了一种苯丙酮酸还原酶的基因，所述基因编码所述的苯丙酮酸还原酶突变体。所述基因由seq id no.2所示核苷酸序列经碱基突变得到。
6、第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包含第二方面的核苷酸序列。所述表达载体为pet系列表达载体。
7、第四方面，本专利技术提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌是包含第三方面的表达载体的大肠杆菌。
8、第五方面，本专利技术提供了一种重组工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)获得突变序列：以野生型序列为模板经过点突变获得突变序列；(2)：构建表达载体：将突变序列与酶切过的质粒同源重组，获得重组表达载体；(3)：构建重组菌：将构建好的重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞中，培养并筛选得到重组工程菌。
9、第六方面，本专利技术提供了一种催化剂，所述的催化剂包含所述的苯丙酮酸还原酶突变体。
10、第七方面，本专利技术还提供所述的突变体或所述的重组工程菌在医药生产、食品领域的应用，如在催化合成苯乳酸中的应用。
11、与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
12、1、本专利技术提供一种高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体。
13、2、本专利技术提供一种包含高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体的催化剂，催化条件温和，酶活效率高，产物手性单一，具有工业化生产应用潜力。
14、3、本专利技术提供编码上述苯丙酮酸还原酶突变体的基因、包含编码上述苯丙酮酸还原酶突变体的基因的表达载体、包含该表达载体的重组菌，本专利技术提供上述苯丙酮酸还原酶突变体的制备及应用方法。
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1.一种高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第193位由天冬酰胺突变为天冬氨酸，第203位由组氨酸突变为精氨酸。
2.一种苯丙酮酸还原酶的基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的苯丙酮酸还原酶突变体。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列经碱基替换得到。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列表达载体。
6.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌是包含权利要求4所述表达载体的大肠杆菌。
7.一种重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.一种催化剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的苯丙酮酸还原酶突变体。
9.一种如权利要求1所述的苯丙酮酸还原酶突变体在催化合成苯乳酸中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，最适反应条件包括反应温度为30℃
...【技术特征摘要】
1.一种高酶活的苯丙酮酸还原酶突变体，其特征在于，将seq id no.1所示氨基酸序列的第193位由天冬酰胺突变为天冬氨酸，第203位由组氨酸突变为精氨酸。
2.一种苯丙酮酸还原酶的基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的苯丙酮酸还原酶突变体。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其由核苷酸序列如seq id no.2所示序列经碱基替换得到。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟斌，林俊涵，谢茹胜，潘志斌，陈秉梅，郑丹梅，黄淞淇，
申请(专利权)人：福建生物工程职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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