【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物燃料电池空气阴极生物材料，具体涉及一种过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法及其应用。
技术介绍
1、微生物燃料电池（mfc）可以利用微生物代谢降解废水中的有机物而发电，实现能源回收和污染物处理的双重效益，具有可持续、无污染、资源利用广泛等特点，在能源和环境领域发展潜力巨大。然而，目前mfc空气阴极的氧还原反应（orr）性能主要依赖于贵金属基电催化剂，其成本高且不能降解污染物，不利于可持续发展。
2、开发绿色可再生的高效微生物orr电催化剂能够有效调控阴极多功能耦合，即同时促进生物发电和有机废物降解。orr在生物呼吸过程中起着重要作用，可用于许多生物电化学装置和系统，如微生物燃料电池、微生物电合成和生物传感等。微生物电催化剂具有优异的可持续性和操作耐久性，然而其应用orr催化的一个重要限制是自身的本征催化活性比较低，这主要归因于细胞内的电催化活性酶/蛋白质数量不足以及细胞膜和集电器之间的电子传递不良。
3、细胞色素c（cyt c）蛋白具有良好的生物电子传导能力和电催化orr性能，在大肠杆菌中，cyt c蛋白的生物合成包括apo-cyt c和heme两个关键结构组分，涉及促进apo-cytc合成的tor y基因和促进heme合成的亚铁螯合酶fech基因。基因工程方法已被用来设计提高电活性微生物的生物合成效率和电子传递速率，其中基因操作和编辑实现了对微生物的基因表达、敲除和降低的有效调控，用于调控微生物电催化剂的生物化学功能。因此，利用基因工程策略可以提高微生物细胞的电子转移效率
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是提供了一种生物安全且绿色可再生的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，该方法制得的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂作为mfc空气阴极的催化材料时，不仅具有良好的界面电子传递效率，而且产生了丰富的orr催化活性蛋白位点，赋予大肠杆菌细胞优秀的电催化orr活性以及微生物燃料电池高效的电生产和含葡萄糖模型有机废水降解的双效功能。
2、本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
3、步骤s1：从ncbi数据库中检索大肠杆菌中细胞色素c蛋白生物合成所需的tor y和fech目的基因信息和编码序列，t7启动子作为启动基因促进转录开始，将tor y和fech目的基因整合到载体质粒pcoladuet-1中构建重组表达质粒cyt c-pcoladuet-1，其中tor y目的基因上游的nco ⅰ酶切位点引物序列为：5'aactttaataaggagatataatgcgagggaaaaaacgcat 3'；tor y目的基因下游的not ⅰ酶切位点引物序列为：5' ctgttcgacttaagcattattcactgtttctcggtaatat 3'；fech目的基因上游的nde ⅰ酶切位点引物序列为：5'taagaaggagatatacatatgcgtcagactaaaaccgg 3'；fech目的基因下游的xho ⅰ酶切位点引物序列为：5'ggtttctttaccagactcgagttagcgatacgcggcaacaag 3'；
4、步骤s2：将步骤s1构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，在lb液体培养基中培养40~80min，再将转化后的大肠杆菌悬液铺展到含有90~120μg ml−1卡那霉素的lb琼脂平板上，于35~40℃生长12~16h用于质粒维持，并挑选单个菌落在lb液体培养基中于35~40℃过夜纯化培养，最后按体积比1:100的比例转接入新的含有90~120μg ml−1卡那霉素的lb液体培养基中，培养3~5h后加入iptg诱导剂至其浓度为0.05~0.6mm，再于10~37℃诱导表达培养4~20h，最终得到过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂。
5、进一步限定，步骤s2中所述重组大肠杆菌以生物安全的大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株。
6、进一步限定，步骤s2中所述lb液体培养基的组成为10g l−1胰蛋白胨、5g l−1酵母提取物和5g l−1氯化钠。
7、本专利技术所述过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂在制备微生物燃料电池空气阴极中的应用，其特征在于具体过程为：将附着过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的碳布电极作为阴极，阴极液为30mm的葡萄糖溶液，涂覆商业pt/c的碳布电极作为阳极，阳极液为1m的葡萄糖溶液，双室之间用质子交换膜隔开，mfc放置于30~37℃的培养箱中，外接2000ω电阻，阴极液通入氧气，阳极液通入氮气。
8、进一步限定，所述阴极的具体制备过程为：将过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂悬浮于lb液体培养基中，并将碳布电极置于lb液体培养基中与重组大肠杆菌共同孵育，最终得到附着过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂生物膜的碳布电极即阴极。
9、进一步限定，所述lb液体培养基的组成为10g l−1胰蛋白胨、5g l−1酵母提取物和5g l−1氯化钠。
10、进一步限定，所述共同孵育时间为24~48h。
11、本专利技术所述过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂在制备三电极半电池工作电极中的应用，三电极半电池中铂片和饱和银/氯化银电极分别作为对电极和参比电极。
12、本专利技术与现有技术相比具有以下优点和有益效果：
13、1、本专利技术的制备方法与化学材料工程方法相比，在基因分子水平上进行设计操作和工程改造，更加精准高效，并且对细胞活力无影响，同时进一步提升了微生物细胞自身的蛋白表达能力和生物化学特性。
14、2、本专利技术根据细胞色素c活性蛋白的结构组成，双基因协同工程高效生产了大量催化活性蛋白位点和血红素催化活性中心，有效提升了全细胞的界面电子传递速率和本征催化活性。
15、3、本专利技术提供的一种过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂作为mfc空气阴极的催化材料时，不仅在半电池中展现出优秀的电催化orr活性，组装成全电池时，仍表现出良好的生物发电和含葡萄糖污水降解的双效功能。
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1.一种过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
2.根据权利要求1所述的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述重组大肠杆菌以生物安全的大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。
3. 根据权利要求1所述的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述LB液体培养基的组成为10g L−1胰蛋白胨、5g L−1酵母提取物和5gL−1氯化钠。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的方法制备的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂在制备微生物燃料电池空气阴极中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于具体过程为：将附着过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的碳布电极作为阴极，阴极液为30mM的葡萄糖溶液，涂覆商业Pt/C的碳布电极作为阳极，阳极液为1M的葡萄糖溶液，双室之间用质子交换膜隔开，MFC放置于30~37℃的培养箱中，外接2000Ω电阻，阴极液通入氧气，阳极液通入氮气。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于阴极的
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述LB液体培养基的组成为10g L−1胰蛋白胨、5g L−1酵母提取物和5g L−1氯化钠。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述共同孵育时间为24~48h。
9.根据权利要求1~3中任意一项所述的方法制备的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂在制备三电极半电池工作电极中的应用，该三电极半电池中铂片和饱和银/氯化银电极分别作为对电极和参比电极。
...【技术特征摘要】
1.一种过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
2.根据权利要求1所述的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于：步骤s2中所述重组大肠杆菌以生物安全的大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株。
3. 根据权利要求1所述的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的制备方法，其特征在于：步骤s2中所述lb液体培养基的组成为10g l−1胰蛋白胨、5g l−1酵母提取物和5gl−1氯化钠。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的方法制备的过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂在制备微生物燃料电池空气阴极中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于具体过程为：将附着过表达细胞色素c的重组大肠杆菌电催化剂的碳布电极作为阴极，阴极液为30mm的葡萄糖溶液，涂覆商业pt/c的碳布电极作为阳极，阳极液为1m的葡萄糖溶液，双室...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，牛洋娣，薛德明，白正宇，张庆，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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