一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学、基因工程技术领域，公开了一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法，步骤如下：步骤1：确定恩拉霉素的卤化酶基因Orf30；步骤2：筛选已经敲除了upp的高产菌株作为出发菌株；步骤3：构建质粒，与链霉菌进行结合转移，移码突变出发菌株；步骤4：对突变菌株进行发酵，对发酵液进行恩拉霉素的提取并且测活；步骤5：通过液质联用鉴定，与原始出发菌株做对比，确定目标产物，得到脱卤素恩拉霉素衍生物。本发明专利技术方法涉及到寻找恩拉霉素合成基因簇中卤化酶基因(Orf30)，利用现代分子生物学遗传育种技术移码突变卤化酶基因，通过发酵测活及液相分析得到脱卤素恩拉霉素衍生物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、基因工程，涉及高产菌株的选育、中间载体的构建、利用抗性进行正向筛选、利用upp基因作为反向筛选、抑菌圈测活法测活、恩拉霉素的提取、液质联用检测鉴定，尤其是一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法和应用。

技术介绍

1、恩拉霉素(enramycin)是从土壤微生物杀真菌链霉菌中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素，又名持久霉素，对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用，且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低等优势，而被广泛应用于家禽养殖业添加到动物的饲料中来促进动物的生长速度，不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。目前恩拉霉素的生产主要由杀真菌链霉菌(streptomyces fungicidicus)发酵获得。据世界卫生组织报道，由于抗生素的误用和过度使用，抗生素耐药性出现及发展的趋势开始加快，对疾病的感染预防和控制也越来越难，因此寻找新的抗生素迫在眉睫。脱卤素恩拉霉素衍生物或许能打破这一壁垒。

2、恩拉霉素的生产菌株是杀真菌链霉菌，本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中通过文献及NCBI数据库查找的杀真菌链霉菌恩拉霉素合成基因簇，根据序列找到Orf30基因序列，通过重叠PCR的方式在卤化酶基因中间插入两个碱基，使其发生移码突变，翻译提前终止。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，使用已经敲除的upp的杀真菌链霉菌，upp作为反向筛选标记可以缩短筛选周期，同时敲除该基因不会影响菌株正常生长，活性与原始菌株相似。筛选的步骤：对菌株进行活化，28℃培养4-6天后挖琼脂块上种子培养基摇床培养，...

【技术特征摘要】

1.一种脱卤素恩拉霉素衍生物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中通过文献及ncbi数据库查找的杀真菌链霉菌恩拉霉素合成基因簇，根据序列找到orf30基因序列，通过重叠pcr的方式在卤化酶基因中间插入两个碱基，使其发生移码突变，翻译提前终止。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，使用已经敲除的upp的杀真菌链霉菌，upp作为反向筛选标记可以缩短筛选周期，同时敲除该基因不会影响菌株正常生长，活性与原始菌株相似。筛选的步骤：对菌株进行活化，28℃培养4-6天后挖琼脂块上种子培养基摇床培养，48小时转接到发酵培养基。经过发酵培养七天后下发酵，离心后去上清，在沉淀中加入浸提液充分震荡混匀，浸提3.5h后，离心取上清，通过抑菌圈测活...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会图，王伊宁，王海宽，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：