【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物检疫，具体涉及一种用于检测茶树坏死环斑病毒的lamp引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、茶树坏死环斑病毒(tea plant necrotic ring blotch virus，tpnrbv)是北岛病毒科(kitaviridae)、蓝莓坏死环斑病毒属(blunevirus)成员。茶树坏死环斑病毒自2018年在中国茶树上首次报道以来，先后在伊朗和日本的茶树上有发生的报道。该病毒粒体为球形，基因组包含4个正单链rna片段，分别为rna1、rna2、rna3和rna4，长度分别为5922nt、4107nt、2678nt和2272nt。茶树坏死环斑病毒的4个rna片段末端均有长度不一的poly(a)结构。rna1的开放阅读框(open reading frame，orf)位于第135-5720核苷酸(nucloetides，nts)位置，编码一个长度为1861个氨基酸的甲基转移酶(methyltransferase，mtr)、类半胱氨酸蛋白酶(cysteine-like protease，c-pro)和解旋酶(helicase,hel)复合体；rna2的orf位于第120-3755nts位置，编码一个长度为1211个氨基酸的解旋酶(hel)和rna依赖的rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase，rdrp)复合体；rna3包含4个orf，分别编码长度为123、250、195和210个氨基酸的未知功能蛋白；rna4的orf位于第384-1331nts位置，编码一个长度为315个氨基酸的运
2、针对茶树坏死环斑病毒，已报道的检测方法主要为普通rt-pcr和实时荧光定量rt-pcr技术。普通rt-pcr检测茶树坏死环斑病毒具有快速、准确、灵敏的优点，但不足的是检测效率仍相对较低，结果判断需要通过琼脂糖凝胶电泳、紫外观察以及pcr产物测序等步骤，易出现假阴性或假阳性，且耗时相对较长。实时荧光定量rt-pcr技术的灵敏度显著高于普通rt-pcr，检测结果可通过荧光定量pcr仪实时监测和判定，但该技术需要价格昂贵的荧光定量pcr仪，不适合在基层单位使用和推广。因此，亟需建立一种速度快、特异性强、灵敏度高、适于基层单位现场使用的茶树坏死环斑病毒检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是建立一种速度快、特异性强、灵敏度高、适于基层单位现场使用的茶树坏死环斑病毒检测方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术首先提供了用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组。
3、本专利技术提供的用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组由外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip和环引物tpnrbv-lf组成；
4、所述外引物tpnrbv-f3为序列1所示的单链dna分子；
5、所述外引物tpnrbv-b3为序列2所示的单链dna分子；
6、所述内引物tpnrbv-fip为序列3所示的单链dna分子；
7、所述内引物tpnrbv-bip为序列4所示的单链dna分子；
8、所述环引物tpnrbv-lf为序列5所示的单链dna分子。
9、上述引物组中，所述外引物tpnrbv-f3、所述外引物tpnrbv-b3、所述内引物tpnrbv-fip、所述内引物tpnrbv-bip和所述环引物tpnrbv-lf的摩尔比为1:1:10:10:2。
10、为了实现上述目的，本专利技术又提供了含有上述引物组的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
11、a1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒；
12、a2)检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒；
13、a3)区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒。
14、上述试剂盒还可包括rna提取试剂、将rna反转录为cdna的试剂和用于环介导等温扩增的其它试剂。
15、进一步的，所述用于环介导等温扩增的其它试剂包括bst dna聚合酶、缓冲液(如10×isothermal amplification buffer)、dntps(如dntp mix)、mg2+(如mgso4)。
16、再进一步的，所述试剂盒还包括荧光染料(如sybr green i)。
17、更进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照(如不携带茶树坏死环斑病毒的健康茶树样品)和阳性对照(如携带茶树坏死环斑病毒的茶树样品)。
18、为了实现上述目的，本专利技术还提供了上述引物组或上述试剂盒的新用途。
19、本专利技术提供了上述引物组或上述试剂盒在如下a1)-a6)中任一种：
20、a1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒；
21、a2)检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒；
22、a3)区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒；
23、a4)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的产品；
24、a5)制备检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒的产品；
25、a6)制备区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的产品。
26、为了实现上述目的，本专利技术还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法。
27、本专利技术提供的鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法为如下s1)或s2)或s3)：
28、所述s1)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过观察浊度曲线判断待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒：若浊度曲线呈“s”型扩增曲线，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若浊度曲线呈水平直线，则待测病毒为或候选为非茶树坏死环斑病毒；
29、所述s2)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，向反应体系中加入荧光染料(如sybr green i)通过观察反应体系颜色变化判断待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒为或候选为非茶树坏死环斑病毒；
30、所述s3)包括如下步骤：提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组，所述引物组由外引物TPNRBV-F3、外引物TPNRBV-B3、内引物TPNRBV-FIP、内引物TPNRBV-BIP和环引物TPNRBV-LF组成；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述外引物TPNRBV-F3、所述外引物TPNRBV-B3、所述内引物TPNRBV-FIP、所述内引物TPNRBV-BIP和所述环引物TPNRBV-LF的摩尔比为1:1:10:10:2。
3.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs和Mg2+。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光染料。
6.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-5任一所述的试剂盒在如下a1)-a6)中任一种：
7.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法，为如下S1)或S2)或S3)：
8.一种检测或辅助检测
9.一种区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的方法，为如下U1)或U2)或U3)：
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的体系包括外引物TPNRBV-F3、外引物TPNRBV-B3、内引物TPNRBV-FIP、内引物TPNRBV-BIP、环引物TPNRBV-LF、Bst DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+；
...【技术特征摘要】
1.用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组，所述引物组由外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip和环引物tpnrbv-lf组成；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述外引物tpnrbv-f3、所述外引物tpnrbv-b3、所述内引物tpnrbv-fip、所述内引物tpnrbv-bip和所述环引物tpnrbv-lf的摩尔比为1:1:10:10:2。
3.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括bst dna聚合酶、缓冲液、dntps和mg2+。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈建国，高芳銮，陈细红，蔡伟，廖富荣，谢丽雪，于翠，张永江，
申请(专利权)人：福州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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