【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说，是一种由m6a甲基化修饰的circist1及其在肝癌诊断、预后评估及治疗中的用途。
技术介绍
1、原发性肝癌包括肝细胞癌(hcc)、肝内胆管癌和其他罕见类型，其中hcc占比为75％～85％。肝细胞癌(以下简称肝癌)具有起病隐匿，早期无明显症状，多数患者在确诊时已处于中晚期的特点。目前肝癌靶向药物较少，探索新的分子治疗靶点，设计新型靶向药物，是肝癌领域研究的热点问题。
2、环状rna(circrna)是一种新的非编码rna，其特点是具有共价闭环结构，没有5'到3'极性，也没有多聚腺苷酸化尾部。最新研究表明，circrnas可作为竞争性内源性rna(cernas)调控基因表达，也可作为micrornas(mirnas)的海绵，阻断mirnas对靶基因的负向调控作用。研究表明，circrnas参与肝癌的恶性进展，如恶性增殖及转移等，可作为肝癌分子治疗靶点。
3、目前尚未有关本专利技术的circrna在诊断、治疗肝癌及肝癌预后中应用的报道。
技术实现思路
1、本专利技术发现了一种新的肝癌相关circrna，并命名为circist1。该circrna定位于16号染色体，71954641-71957283序列，由ist1基因6号、7号、8号、9号外显子首位拼接而成，其环化的核苷酸序列有495个碱基。本专利技术的目的在于提供一种由m6a甲基化修饰的circist1及其在肝癌诊断、预后评估及治疗中的用途。
2、缺氧诱导因子(hif)
3、研究表明，缺氧诱导因子hif-1α在调控肝癌发生发展中发挥重要作用，包括上皮-间质转化(emt)和细胞外基质的侵袭。此外，hif-1α诱导hcc中参与血管生成、葡萄糖代谢、增殖、侵袭和转移等相关基因的转录，促进肝癌进展。如何抑制hif-1α表达，是治疗肝癌新的切入点。
4、本专利技术通过体内外实验表明，在肝癌中沉默环状rna ist1的表达，可以促进mir-140-3p和mir-182对hif-1α的负向调控作用，从而抑制hif-1α的表达，阻止肝癌细胞的恶性增殖和转移。
5、为了探索circrnas在肝细胞癌(hcc)中的功能，本专利技术采用生物信息学分析了geo数据库中6对hcc组织和癌旁组织中circrna表达谱(数据集号：gse164803)进行了分析，结果表明circist1(hsa_circ_0005016)是表达最为显著且未见报道的circrna。采用qrt-pcr技术进一步分析了肝癌患者组织中circist1的表达情况。结果显示，在80对肝癌及癌旁组织中，circist1的表达显著高于邻近的正常组织。此外，高表达circist1的肝癌患者的临床预后较差，包括总生存率和无病生存率较低等。结果提示，circist1参与了肝癌的恶性进展，可作为潜在的诊断和治疗靶点。
6、由于circist1是首次被发现，因此本专利技术对其环状结构进行了鉴定。提取肝癌细胞系hcclm3和hep3b细胞的总rna，使用circist1功能区特异引物或ist1共用引物进行反向pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离。数据显示，特征引物和普通引物都能扩增circist1，但线性ist1只能用普通引物扩增。用rnase r处理hcclm3和hep3b细胞，用rt-qpcr检测ist1或circist1的表达。结果显示，rnase r能显著降低ist1的表达，但不影响circist1的表达。此外，本专利技术用放线菌素d处理hcclm3和hep3b细胞6、12和24小时，然后检测ist1或circist1的mrna。数据显示，circist1的半衰期比ist1长。qrt-pcr结果显示，circist1主要位于hcclm3和hep3b细胞的细胞质中，这表明circist1可能具有mirna海绵的功能。
7、基于上述技术方案，本专利技术的第一方面，提供一种环状rna分子circist1，其核苷酸序列如seq id no.1所示：
8、gttgctgatcagctctgtgccaagtatagcaaggaatatggcaagctatgtaggaccaaccagattggaactgtgaatgacaggctaatgcacaagctgagtgtggaagccccacccaaaatcctggtggagagatacctgattgaaattgcaaagaattacaacgtaccctatgaacctgactctgtggtcatggcagaagctcctcctggggtagagacagatcttattgatgttggattcacagatgatgtgaagaaaggaggccctggaagaggagggagtggtggcttcacagcaccagttggtggacctgatggaacggtgccaatgcccatgcccatgcccatgcctatgccatctgcaaatacgcctttctcatatccactgccaaagggaccatcagatttcaatggactgccaatggggacttatcaggcctttcccaatattcatccacctcagataccagcaactcccccatcgtatgaatct(seq id no.1)。
9、进一步的，本专利技术还提供所述的circist1的反剪接连接位点(图1)。
10、本专利技术的第二方面，提供检测circist1的表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
11、进一步的，所述的circist1作为肝癌诊断标志物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
12、进一步的，所述的试剂盒包含检测生物样品中circist1表达水平的试剂。
13、进一步的，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
14、本专利技术发现circist1在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，表明circist1可能参与hcc的恶性进展，并可作为hcc诊断的生物标志物(图4)。
15、本专利技术的第三方面，提供检测circist1的表达水平的试剂在制备肝癌患者预后评估试剂盒中的应用。
16、进一步的，所述的circist1作为肝癌预后评估标志物在制备判断肝癌患者预后的试剂盒中的应用。
17、进一步的，所述的应用中，高表达circist1的肝癌患者的临床预后较差，包括总生存率和无病生存率较低等。
18、进一步的，所述的检测circist1的表达水平的试剂，选自：对circist1表达水平具有检测特异性的探针、基因芯片，或pcr引物。
19、进一步的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环状RNA分子circIST1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.检测circIST1的表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
3.检测circIST1的表达水平的试剂在制备肝癌患者预后评估试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的检测circIST1的表达水平的试剂，选自：对circIST1表达水平具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的对circIST1的表达水平具有检测特异性的PCR引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示。
6.一种肝癌诊断和预后评估的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测circIST1的表达水平的试剂。
7.沉默或抑制circIST1表达的试剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的沉默或抑制circIST1表达的试剂选自：
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的
10.一种治疗肝癌的药物，其活性成分为沉默或抑制circIST1表达的试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种环状rna分子circist1，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.检测circist1的表达水平的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
3.检测circist1的表达水平的试剂在制备肝癌患者预后评估试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的检测circist1的表达水平的试剂，选自：对circist1表达水平具有检测特异性的探针、基因芯片，或pcr引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的对circist1的表达水平具有检测特异性的pcr引物，其核苷酸序列分别如seq...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍蕾蕾，展洋洋，黄月英，吕磊，解方园，陈春，江雪，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。