【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检测，具体涉及一种可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组及试剂盒。
技术介绍
1、猪肠病毒g型（porcine enterovirus g，ev-g）属于小rna病毒科（picornaviridae）肠病毒属（enterovirus）病毒，最早的原型毒株“ukg/410/73”于1973年从英国出现皮肤症状的猪只中分离获得。各年龄段的家猪及野猪均易感，ev-g感染仔猪，可导致肠道黏膜和皮肤损伤，出现腹泻和皮肤丘疹等临床症状，同时ev-g具有很强的噬神经性，可侵染被感染仔猪的脊髓和大脑，导致仔猪出现后肢麻痹、异常兴奋等神经症状，ev-g感染对仔猪健康生长造成潜在威胁。目前，ev-g在世界范围猪群中呈现广泛流行的态势，在英国、美国、巴西、德国、匈牙利、西班牙、捷克、中国、日本、韩国、泰国、越南等国家均已被发现。
2、ev-g基因组为单股正链rna，长度约7400-7500nt，由一个开放阅读框（openreading frame，orf）和5’端、3’端非编码区（untranslated region，utr）组成，orf区编码1个多聚蛋白，被自身携带的特异性蛋白酶切割为4种结构蛋白（vp1、vp2、vp3、vp4）和7种非结构蛋白（2apro、2b、2c、3a、3b、3cpro、3dpol）。不同ev-g毒株vp1基因核苷酸序列差异度较大，据此可将ev-g分为不同的基因型，目前世界范围共发现20种基因型（ev-g-1至ev-g-20）。近年来，世界各地陆续报道了一种ev-g与猪环曲病毒（p
3、目前，关于ev-g的检测方法主要有抗体检测和核酸检测两种。抗体检测方法为基于ev-g vp2、vp3蛋白多克隆抗体的间接elisa检测方法，但elisa检测包括抗原包被、封闭、一抗孵育、酶标二抗孵育、显色和测定等多个步骤，操作过程繁琐，整体耗时较长，且血清中的特异性病毒抗体通常在病毒感染后5至10天才产生，因此，抗体elisa检测方法无法在病毒感染初期使用。核酸检测方法主要有常规rt-pcr和实时荧光定量rt-pcr方法。目前，ev-g常规rt-pcr检测方法耗时长（2至3小时），灵敏度低，检测结果需进行电泳检测才能判定。同时，ev-g的实时荧光定量rt-pcr检测方法相较于常规rt-pcr，虽然实时荧光定量rt-pcr的检测灵敏度和检测效率都有较大提高，但是实时荧光定量rt-pcr检测，需要使用荧光定量pcr仪等昂贵的仪器设备，不适合基层及现场快速检测。
4、病原的现场可视化快速检测，对于快速、准确、有效地处置疫情具有十分重要的意义，因此，现场可视化“病原快速检测技术”已成为传染病诊断、防控的重要手段。2000年，日本科学家专利技术了一种核酸扩增方法：环介导等温扩增（loop mediated isothermalamplification, lamp）技术。该方法利用bst dna聚合酶的链置换活性，针对靶基因的6个保守区域设计4条特异性引物，在64℃恒温条件下反应约1h即可完成扩增，加入环引物后还可大大缩短反应时间，仅需20至30min左右即可完成扩增过程。在反应体系中加入ph指示剂“酚红”或者“钙黄绿素和mn2+”等，通过肉眼观察反应液颜色变化，即可实现检测结果的现场判定。lamp检测方法与其它病原检测技术相比，无需昂贵的仪器设备，反应过程在恒温水浴锅中即可完成，检测速度快，肉眼即可判定结果，非常适合病原的现场快速检测，已广泛应用于多种病原微生物的检测。然而国内外尚未建立ev-g rt-lamp检测方法，极大的制约了ev-g的现场流行病学调查。因此如何克服现有技术的不足是目前微生物检测
亟需解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组及试剂盒。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组，包括5条引物，分别为两条外引物、两条内引物和一条环引物；
4、所述的两条外引物为正向外引物ev-g/p5-f3和反向外引物ev-g/p5-b3；
5、所述的两条内引物为正向内引物ev-g/p5-fip和反向内引物ev-g/p5-bip；
6、所述的环引物为上游环引物ev-g/p5-lf；
7、所述5条引物的核苷酸序列如下：
8、正向外引物ev-g/p5-f3：5’-tgtacccacggccgaag-3’(seq id no.1)；
9、反向外引物ev-g/p5-b3：5’-ccggaggactaccaactagc-3’(seq id no.2)；
10、正向内引物ev-g/p5-fip：5’-tgagcgaaacgccaagacagattatccggccagctacttcg-3’(seq id no.3)；
11、反向内引物ev-g/p5-bip：5’-gatgggtctccgcathccccacatggcgtcctatggctttc-3’(seq id no.4)；
12、上游环引物ev-g/p5-lf：5’-ctttgatgytactaggcttc-3’(seq id no.5)。
13、进一步，引物组中，ev-g/p5-f3、ev-g/p5-b3、ev-g/p5-fip、ev-g/p5-bip和ev-g/p5-lf的摩尔比为1：1：4：4：3。
14、本专利技术同时提供上述可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组的rt-lamp试剂盒。
15、进一步，包括rt-lamp反应预混液、阳性对照和阴性对照；
16、rt-lamp反应预混液包含：浓度为5 μm的正向外引物ev-g/p5-f3 1μl、浓度为5 μm的反向外引物ev-g/p5-b3 1μl；浓度为20 μm的正向内引物ev-g/p5-fip 1μl、浓度为20 μm的反向内引物ev-g/p5-bip 1μl；浓度为15 μm的上游环引物ev-g/p5-lf 1μl，rt-lamp反应液12.5μl和nuclease-free水4.5μl；
17、所述的阳性对照为含有ev-g扩增靶序列的重组质粒，其中，ev-g扩增靶序列的核苷酸序列见seq id no.7所示；阴性对照为nuclease-free水。
18、进一步，含有ev-g扩增靶序列的重组质粒的拷贝数为4.68×105拷贝/ul。
19、进一步，rt-lamp试剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组，其特征在于，包括5条引物，分别为两条外引物、两条内引物和一条环引物；
2.根据权利要求1所述的可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组，其特征在于：引物组中，EV-G/P5-F3、EV-G/P5-B3、EV-G/P5-FIP、EV-G/P5-BIP和EV-G/P5-LF的摩尔比为1：1：4：4：3。
3.含有权利要求1或2所述可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒。
4.根据权利要求3所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP反应预混液、阳性对照和阴性对照；
5.根据权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，含有EV-G扩增靶序列的重组质粒的拷贝数为4.68×105拷贝/uL。
6.根据权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：>
7.根据权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：RT-LAMP扩增的反应程序为：64℃恒温30min，80℃恒温10min终止反应。
8.一种用于非疾病诊断与治疗目的的鉴别待检病毒是否为猪肠病毒G型的方法，采用权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种用于非疾病诊断与治疗目的的鉴定待检样本是否含有猪肠病毒G型的方法，采用权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒G型的RT-LAMP引物组的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组，其特征在于，包括5条引物，分别为两条外引物、两条内引物和一条环引物；
2.根据权利要求1所述的可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组，其特征在于：引物组中，ev-g/p5-f3、ev-g/p5-b3、ev-g/p5-fip、ev-g/p5-bip和ev-g/p5-lf的摩尔比为1：1：4：4：3。
3.含有权利要求1或2所述可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组的rt-lamp试剂盒。
4.根据权利要求3所述的含有可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组的rt-lamp试剂盒，其特征在于，包括rt-lamp反应预混液、阳性对照和阴性对照；
5.根据权利要求4所述的含有可视化快速检测猪肠病毒g型的rt-lamp引物组的rt-lamp试剂盒，其特征在于，含有ev-g扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：李占鸿，宋建领，朱沛，张振兴，李卓然，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：
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