重组枯草芽孢杆菌工程菌株及其在生物制备烟酰胺单核苷酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，公开了一种重组枯草芽孢杆菌工程菌株及其在生物制备烟酰胺单核苷酸中的应用。本发明专利技术提供了一种高效稳定表达烟酰胺核苷激酶(NRK)的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，同时又构建烟酰胺核苷激酶和乙酸激酶的融合基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，并通过CRISPR‑Cpf1技术降低枯草芽孢杆菌中消耗ATP酶基因的转录与表达，实现一种高效的合成烟酰胺单核苷酸的方法。在生物合成时，以烟酰胺核糖作为底物，在烟酰胺核苷激酶的作用下结合ATP，一步反应合成得到烟酰胺单核苷酸与副产物ADP。重组枯草芽孢杆菌工程菌株能够高效且稳定的生物合成烟酰胺单核苷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，具体涉及一种重组枯草芽孢杆菌工程菌株及其在生物制备烟酰胺单核苷酸中的应用。

技术介绍

1、烟酰胺单核苷酸(nmn)是目前被广泛应用于人体口服的膳食营养补充剂。烟酰胺单核苷酸作为nad+的直接前体，人体服用后可直接结合atp生成nad+，从而提升nad+水平或改善nad+消耗酶引起的nad+缺陷。烟酰胺单核苷酸已被证明可以改善心血管疾病如血管老化、缺血型损伤；代谢性疾病如糖尿病、肥胖以及神经系统疾病如阿尔兹海默症、帕金森等相关疾病。同时也可以改善衰老过程中伴随的并发症如骨质疏松、不同程度炎症以及老年黑色素等。

2、烟酰胺单核苷酸的来源主要有三种途径：天然来源、化学合成和生物合成。天然来源如铁皮石斛等药材；西兰花、卷心菜、牛油果等水果蔬菜，但提取纯度较低；化学合成虽操作简单，试剂廉价，但工艺中化学有毒试剂等问题，成为了工业技术转化的瓶颈；生物合成具有绿色、简便和高效等优点，由于酶稳定性低，蛋白提取纯化工作繁杂等问题仅限于实验室操作，难以工业化。

3、现有技术中合成烟酰胺单核苷酸的方法见表1。</p>

4、表1本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，该重组枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌为宿主菌，进一步包含表达烟酰胺核苷激酶和表达烟酰胺核苷激酶-乙酸激酶融合基因的重组载体，以及任选的表达CRISPR-Cpf1基因编辑系统的重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，烟酰胺核苷激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，烟酰胺核苷激酶-乙酸激酶融合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌株包括枯草芽孢杆菌WB800N。

<p>4.权利要求1-...

【技术特征摘要】

1.一种重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，该重组枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌为宿主菌，进一步包含表达烟酰胺核苷激酶和表达烟酰胺核苷激酶-乙酸激酶融合基因的重组载体，以及任选的表达crispr-cpf1基因编辑系统的重组载体。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，烟酰胺核苷激酶的氨基酸序列如seq id no:4所示，烟酰胺核苷激酶-乙酸激酶融合酶的氨基酸序列如seq idno:5所示；

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌株包括枯草芽孢杆菌wb800n。

4.权利要求1-3中任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株在生物制备烟酰胺单核苷酸中的应用。

5.一种基于权利要求1-3中任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌株生物制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，催化反应的温度为35-40℃，优选为37℃。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，催化反应的时间为2-4h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌工程菌株上清液培养方法为：将种子液接入至液体lb培养基中，使得相对于1ml种子液，液体lb培养基的用量为40-60ml；在35-40℃、150-250rpm培养5-6h；当菌体量长至对数生长期时，加入终浓度为1-1.5mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，在16℃-25℃、150-250rpm继续培养18-21h，得到的菌液再离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：张镨月，叶子茹，蒋桂林，杨雨珂，梁芳，裴文亮，黄永，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：