一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法及其应用，属于农业技术领域。本发明专利技术中的方法主要包括取样、测序和生信分析三方面，其中取样获取的是单个水稻小孢子性细胞。本发明专利技术成功分离出单个水稻小孢子性细胞，并对已有水稻单细胞变异检测技术流程所存在的完整性不强、检测连贯性有待提升等缺陷进行了完善，此外还通过重离子诱变技术，鉴定确认了变异位点的真实性。本发明专利技术中的方法拓宽了水稻单细胞诱变材料的来源范围，为创制更多样的育种材料、进行更高效的诱变育种提供了新的思路和方法。同时小孢子性细胞作为雄配子，基因组携带的突变能够通过杂交进入子代，可实现变异的遗传和固定，也为优异变异基因的快速利用提供了途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业，尤其涉及一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法及其应用。

技术介绍

1、诱变育种是作物中一种常见的育种途径，在创制生物安全性高、可直接用于种质选育的优异新基因方面具有较大优势。传统诱变育种对植物诱变材料的研究水平多集中在组织、器官水平，这种传统的测序思路只能反映细胞的平均数据，不能提供单个细胞之间的异质性信息，不利于进行细胞水平精细化、针对性的变异挖掘和利用，进而可能忽略单细胞中特有的位点变异。

2、随着基因组测序技术和生物信息学的飞速发展，对变异机理的研究起到了极大的促进作用。全基因组重测序在植物诱变育种领域应用最为广泛，极大地降低某些未知功能的重要基因序列的鉴定障碍，使诱变基因资源得到充分的挖掘和利用，为相关研究提供技术支撑。单细胞全基因组测序技术(single-cell whole-genome sequencing，scwgs)在单细胞分辨率下揭示了生物样本中的基因组异质性，弥补传统测序方法的不足，帮助我们理解植物发育过程中细胞的独特性功能。

3、相对动物细胞而言，单细胞测序在植物中的研究应用较少。植物细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞的分离方法具体为：先通过FDA-PI对小孢子进行染色，然后在20倍物镜的荧光显微镜下观察细胞活性，最后通过拉尖的玻璃毛细管连接微量注射器制作的简易单细胞分离装置，吸取单个存活的单核早期小孢子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单细胞的DNA扩增方法具体为：在单细胞样品中加入3μL Buffer D2，轻弹管壁混匀并短暂离心收集；65℃孵育10分钟；加入3μLBuffer N，轻弹管壁混匀并短暂离心；将40μL的反应混合液加入到准备...

【技术特征摘要】

1.一种检测水稻单细胞基因序列变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞的分离方法具体为：先通过fda-pi对小孢子进行染色，然后在20倍物镜的荧光显微镜下观察细胞活性，最后通过拉尖的玻璃毛细管连接微量注射器制作的简易单细胞分离装置，吸取单个存活的单核早期小孢子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单细胞的dna扩增方法具体为：在单细胞样品中加入3μl buffer d2，轻弹管壁混匀并短暂离心收集；65℃孵育10分钟；加入3μlbuffer n，轻弹管壁混匀并短暂离心；将40μl的反应混合液加入到准备好的10μldna样品中，轻弹管壁混匀并短暂离心收集，30℃孵育3-4小时；65℃孵育5分钟失活discover-scdnapolymerase；将扩增好的dna样品进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，主条带清晰明亮的dna样品放入-80℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过磁珠进行纯化时具体使用的磁珠为ampure xp磁珠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述因为基因组背景差异造成的假阳性数据去除方法为：若测序品种和gatk比对使用的参考基因组品种不一致，则材料本身的基因组背景有差异，设置10个空白对照样品，统计空白对照样品的测序的变异位点，对比到辐照样品中，相同的位点即认为是来源于基因组背景的差异，进行筛除。

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【专利技术属性】
技术研发人员：沈任佳，郭涛，孙凯，王慧，黄翠红，周丹华，王加峰，肖武名，杨瑰丽，王键宽，吴满，陈志强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：