【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于表达annexin v蛋白的重组质粒及annexin v蛋白的制备方法。
技术介绍
1、annexin v是一种分子量为35-36kd的ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸(ps)高亲和力特异性结合。在细胞凋亡早期，只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸(ps)会翻向外侧，annexin v通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了荧光素的annexin v作为荧光探针搭配pi、7-aad、dapi等核酸染料使用，能够准确区分正常细胞、凋亡早期和凋亡晚期细胞。但是目前annexin v蛋白的制备方法流程复杂，产品纯度低，生产效率低。
2、大肠杆菌表达系统是重组蛋白工业生产中最常用的一种原核表达系统，其具有体系成熟、遗传背景清晰、生产成本低、表达量高、研发和生产周期短以及易于放大等优点。瞬时转染高拷贝的质粒搭配诱导表达的方式能够极大地提高大肠杆菌表达外源蛋白的效率并且有利于外源蛋白的大量积累。
3、iptg(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)作为一种乳糖类似物，不被菌体代谢，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以iptg的诱导效率高，往往只需要很少量即可达到理想诱导效果。由于iptg不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于
2、实现上述目的的技术方案是：一种用于表达annexin v蛋白的重组质粒，使用6×his作为纯化标签并基于此设计annexin v的表达阅读框，用于表达annexin v蛋白的重组质粒依次由上游限制性内切酶位点、6×his标签、tev酶的酶切位点、表达annexin v蛋白的核苷酸序列以及下游限制性内切酶位点组成；质粒骨架选择具有卡那霉素抗性基因的pet28b(+)。
3、上述的用于表达annexin v蛋白的重组质粒，其中，所述上游限制性内切酶位点为ncoi。
4、上述的用于表达annexin v蛋白的重组质粒，其中，所述下游限制性内切酶位点为bamhi。
5、本专利技术还提供了一种annexin v蛋白的制备方法，包括以下步骤：
6、s1，将上述的重组质粒通过热激的方式转化至大肠杆菌bl21(de3)宿主菌中，得到高效表达annexin v蛋白的转化株菌种；
7、s2，将冻存的高效表达annexin v蛋白的转化株菌种以1％的接种量接种至5-10ml含有kan抗性的lb液体培养基中，37℃，200rpm，摇床培养获取一级种；将一级种以1％的接种量接种至含有kan抗性的lb液体培养基中37℃，200rpm，摇床培养二级种；二级种培养至菌液od600＝0.7-0.9时加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，20℃，200rpm，摇床培养，诱导表达annexin v；
8、s3，诱导表达后的菌液通过冷冻离心机，6000rpm，4℃离心15min收集菌体；收集到的菌体使用10 -15ml、ph＝7.2 -7.4磷酸盐缓冲液重悬洗涤一次，再次离心收集菌体；每100ml菌液得到的菌体加入6-7ml、ph＝7.2 -7.4磷酸盐缓冲液重悬，后置于超声破碎仪中，超声破碎，直至菌液澄清；然后将澄清的破碎液置于冷冻离心机中，12000rpm，4℃离心40min，收集上清使用0.22μm的pes滤膜过滤后备用；
9、s4，ni-nta亲和层析纯化：使用3-5个柱体积的超纯水清洗掉ni-nta亲和层析柱中的保护液；使用5-8个柱体积的第一缓冲液平衡ni-nta亲和层析柱；将步骤s3中过滤后的上清液缓慢流过ni-nta亲和层析柱并收集流穿液以做鉴定；使用5 -10个柱体积的第一缓冲液清洗杂蛋白；使用90％的第一缓冲液混合10％的第二缓冲液持续清洗ni-nta亲和层析柱，洗去杂蛋白；使用75％的第一缓冲液和25％的第二缓冲液继续洗脱，收集洗脱液即获得携带6×his标签的annexin v蛋白；
10、s5，每毫克携带6×his标签的annexin v蛋白添加携带6×his标签的重组tev酶1ku，在酶切缓冲体系中4℃摇床孵育16小时进行酶切；将酶切后的蛋白混合溶液加载至使用第一缓冲液平衡过后的ni-nta亲和层析柱中，收集流穿液即获得不携带6×his标签的annexin v蛋白。
11、上述的annexin v蛋白的制备方法，步骤s4中，所述第一缓冲液由50mmol/l的磷酸盐缓冲液、500mmol/l的氯化钠和20mmol/l咪唑组成，ph＝7.2-7.4；
12、所述第二缓冲液由50mmol/l的磷酸盐缓冲液、500mmol/l的氯化钠和500mmol/l咪唑组成，ph＝7.2-7.4。
13、上述的annexin v蛋白的制备方法，步骤s4中，携带6×his标签的annexin v蛋白的氨基酸序列为：
14、mgsshhhhhhssgenlyfqshmaqvlrgtvtdfpgfderadaetlrkamkglgtdeesiltlltsrsnaqrqeisaafktlfgrdllddlkseltgkfeklivalmkpsrlydayelkhalkgagtnekvlteiiasrtpeelraikqvyeeeygssleddvvgdtsgyyqrmlvvllqanrdpdagideaqveqdaqalfqagelkwgtdeekfitifgtrsvshlrkvfdkymtisgfqieetidretsgnleqlllavvksirsipaylaetlyyamkgagtddhtlirvmvsrseidlfnirkefrknfatslysmikgdtsgdykkallllcgedd。
15、上述的annexin v蛋白的制备方法，步骤s5中，所述酶切缓冲体系由50mmol/l的tris-hcl、50mmol/l的氯化钠、0.5mmol/l的edta和1mmol/l的dtt组成，ph＝8.0。
16、本专利技术的用于表达annexin v蛋白的重组质粒及annexin v蛋白的制备方法，表达量高，纯化工艺简单、成本低廉，所获最终产品纯度高、活性好。
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1.一种用于表达Annexin V蛋白的重组质粒，其特征在于，使用6×His作为纯化标签并基于此设计Annexin V的表达阅读框，用于表达Annexin V蛋白的重组质粒依次由上游限制性内切酶位点、6×His标签、TEV酶的酶切位点、表达Annexin V蛋白的核苷酸序列以及下游限制性内切酶位点组成；质粒骨架选择具有卡那霉素抗性基因的pET28b(+)。
2.根据权利要求1所述的用于表达Annexin V蛋白的重组质粒，其特征在于，所述上游限制性内切酶位点为NcoI。
3.根据权利要求1所述的用于表达Annexin V蛋白的重组质粒，其特征在于，所述下游限制性内切酶位点为BamHI。
4.一种Annexin V蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的Annexin V蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述第一缓冲液由50mmol/L的磷酸盐缓冲液、500mmol/L的氯化钠和20mmol/L咪唑组成，pH＝7.2-7.4；
6.根据权利要求4所述的Annexin V蛋白的制备方法，其特
7.根据权利要求4所述的Annexin V蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述酶切缓冲体系由50mmol/L的Tris-HCl、50mmol/L的氯化钠、0.5mmol/L的EDTA和1mmol/L的DTT组成，pH＝8.0。
...【技术特征摘要】
1.一种用于表达annexin v蛋白的重组质粒，其特征在于，使用6×his作为纯化标签并基于此设计annexin v的表达阅读框，用于表达annexin v蛋白的重组质粒依次由上游限制性内切酶位点、6×his标签、tev酶的酶切位点、表达annexin v蛋白的核苷酸序列以及下游限制性内切酶位点组成；质粒骨架选择具有卡那霉素抗性基因的pet28b(+)。
2.根据权利要求1所述的用于表达annexin v蛋白的重组质粒，其特征在于，所述上游限制性内切酶位点为ncoi。
3.根据权利要求1所述的用于表达annexin v蛋白的重组质粒，其特征在于，所述下游限制性内切酶位点为bamhi。
4.一种annexin v蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：张薇，崔涵，吴伟，
申请(专利权)人：宝天生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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