【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物标志物检测，尤其是指一种基于银纳米团簇荧光响应体系的叶酸检测方法。
技术介绍
1、叶酸是一种关键的水溶性维生素b，在生物体的正常生命过程中承担重要的生理机能，对于细胞分裂、dna合成与修复以及氨基酸代谢具有不可或缺的重要性。叶酸来源于绿叶蔬菜，缺少叶酸会诱发贫血、白血球减少症、心智发展不足和精神病等，孕妇、乳母及处于生长发育旺盛期的婴幼儿，对于也算的需求量则更高。而过多摄入叶酸，会引起维生素b-12缺乏，从而增加老年人患神经性疾病的概率，因此监控叶酸在体内的含量水平有着重要意义。在临床检测中，叶酸水平主要通过两种方式进行评估：血清(血浆)检测和红细胞检测。虽然血清学检测是常用的方法，但其仅能反映近期的叶酸摄入量，易受到一过性膳食因素的影响，浓度波动性较大。更重要的是，其浓度对于预防出生缺陷的参考价值并未得到学术界的广泛认同。与此相对，红细胞内的叶酸更能体现体内叶酸的长期存储水平，且不易受短期叶酸摄入的影响，因此被视为更可靠的叶酸指标。
2、目前，常规叶酸检测方法主要包括高效液相色谱法、质谱法、微生物法、化学发光法等。然而，这些方法操作复杂，并高度依赖于大型仪器。这不仅使得叶酸的快速检测变得困难，也使得这些技术在基层医疗机构和偏远地区的普及应用变得难以实现。因此，开发新型的叶酸检测技术显得尤为重要。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于银纳米团簇荧光响应体系的叶酸检测方法，通过在缓冲液中混合叶酸结合蛋白、聚蔗糖400、硝酸银和柠
2、本专利技术的第一个目的是提供一种基于银纳米团簇荧光响应体系的叶酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3、步骤s1、在缓冲液中将叶酸结合蛋白、银离子、柠檬酸钠和聚蔗糖400在避光条件下混合反应，使银离子在叶酸结合蛋白中原位还原矿化纳米银，形成银纳米团簇；
4、步骤s2、混合银纳米团簇荧光响应体系与不同浓度的叶酸标准溶液，检测荧光强度的增幅，建立叶酸和荧光强度的线性关系；
5、步骤s3、取待测样本与银纳米团簇荧光响应体系混合，避光条件下共同孵育，根据荧光强度的增幅计算待测样本中叶酸的浓度。
6、银纳米团簇原位还原在叶酸结合蛋白中含有巯基的氨基酸位点上，形成小颗粒的金属团簇，具有荧光性质，且由于银纳米团簇的体积较小，金属核心尺寸小于2nm，因此不影响叶酸结合蛋白质的活性，使叶酸结合蛋白仍能与叶酸结合。
7、聚蔗糖400包围经叶酸结合蛋白修饰的银纳米团簇，使其维持较为稳定的蛋白质构象，保护其对叶酸的识别性能。
8、进一步地，步骤s1中，建立银纳米团簇荧光响应体系后还包括加入辅酶q10的步骤。
9、进一步地，辅酶q10的终浓度为0.1-1.5％(w/v)。
10、优选地，辅酶q10的终浓度为1％(w/v)。
11、辅酶q10用于保持叶酸荧光响应探针的稳定性，辅酶q10起到抗氧化剂的作用，保护银纳米团簇免受水溶液和空气中氧气对其的氧化作用。
12、进一步地，步骤s1中，缓冲液为mops缓冲液。
13、进一步地，mops缓冲液由5mmol/l的3-(n-吗啉代)丙磺酸与120mmol/l的氢氧化钾混合。
14、进一步地，缓冲液ph值为6.0-7.0。
15、进一步地，步骤s1中，硝酸银的终浓度为0.3-0.5mm，叶酸结合蛋白的终浓度为0.05-0.2mm，柠檬酸钠的终浓度为1-1.3mm，聚蔗糖400的终浓度为5-15％(w/v)。
16、优选地，硝酸银的终浓度为0.4mm，叶酸结合蛋白的终浓度为0.1mm，柠檬酸钠的终浓度为1.2mm，聚蔗糖400的终浓度为10％(w/v)。
17、进一步地，步骤s1中，震荡时间为7-10分钟。
18、进一步地，步骤s1中，静置时间为7-9小时。
19、进一步地，步骤s1中，温度为0-10℃。
20、优选地，温度为4℃。
21、进一步地，步骤s3中，待测样本与银纳米团簇荧光响应体系的体积比为(0.5-2):1。
22、优选地，待测样本与银纳米团簇荧光响应体系的体积比为1:1。
23、进一步地，步骤s3中，孵育的时间为30-60分钟。
24、本专利技术的第二个目的是提供银纳米团簇荧光响应体系在制备红细胞叶酸检测产品中的应用，银纳米团簇荧光响应体系的制备为在缓冲液中将叶酸结合蛋白、银离子、柠檬酸钠和聚蔗糖400在避光条件下混合反应得到，其中叶酸结合蛋白终浓度为0.05-0.2mm，银离子终浓度为0.3-0.5mm，柠檬酸钠终浓度为1-1.3mm，聚蔗糖400的终浓度为5-15％(w/v)。
25、进一步地，建立银纳米团簇荧光响应体系后还包括加入辅酶q10的步骤，辅酶q10的终浓度为0.1-1.5％(w/v)。
26、进一步地，红细胞叶酸检测产品的使用方法包括以下步骤：
27、步骤s1、混合银纳米团簇荧光响应体系与不同浓度的叶酸标准溶液，检测荧光强度的增幅，建立叶酸和荧光强度的线性关系；
28、步骤s2、取待测样本与银纳米团簇荧光响应体系混合，避光条件下共同孵育，根据荧光强度的增幅计算待测样本中叶酸的浓度。
29、进一步地，待测样本为全血样本时，还包括对样本进行预处理的步骤，预处理为将全血样本与抗坏血酸溶液混合，得到溶血溶液。
30、进一步地，抗坏血酸溶液的终浓度为1-2％(w/v)。
31、优选地，抗坏血酸溶液的终浓度为1.5％(w/v)。
32、进一步地，全血样本与抗坏血酸溶液的体积比为1:(10-30)。
33、优选地，全血样本与抗坏血酸溶液的体积比为1:20。
34、本专利技术的有益效果：
35、(1)本专利技术提供的银纳米团簇荧光响应体系通过荧光信号变化，依靠荧光分光光度法实现对叶酸浓度的定量检测，操作简单、灵敏度高、成本低廉，且不需要大型复杂仪器，能够快速实现对样本的检测。加入辅酶q10增强了荧光响应体系的稳定性，使其在冷藏30天后仍能保持较高的检测活性。
36、(2)本专利技术提供的叶酸检测方法特异性强，灵敏度高，与临床检验方法一致性好，检测限低至2.5ng/ml，检测范围大。在检测过程中无需对待测全血样本进行特殊处理，处理简单，节约了检测时间，有良好的推广前景。
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1.一种基于银纳米团簇荧光响应体系的叶酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S1中，建立银纳米团簇荧光响应体系后还包括加入辅酶Q10的步骤。
3.根据权利要求2所述的叶酸检测方法，其特征在于：所述辅酶Q10的终浓度为0.1-1.5％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S1中，缓冲液的pH值为6.0-7.0。
5.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S1中，叶酸结合蛋白终浓度为0.05-0.2mM，银离子终浓度为0.3-0.5mM，柠檬酸钠终浓度为1-1.3mM，聚蔗糖400的终浓度为5-15％(w/v)。
6.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S1中，温度为0-10℃。
7.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S3中，待测样本与银纳米团簇荧光响应体系的体积比为(0.5-2):1。
8.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤S3中，所述孵育的时间为3
9.银纳米团簇荧光响应体系在制备红细胞叶酸检测产品中的应用，其特征在于，所述银纳米团簇荧光响应体系的制备为在缓冲液中将叶酸结合蛋白、银离子、柠檬酸钠和聚蔗糖400在避光条件下混合反应得到，其中叶酸结合蛋白终浓度为0.05-0.2mM，银离子终浓度为0.3-0.5mM，柠檬酸钠终浓度为1-1.3mM，聚蔗糖400的终浓度为5-15％(w/v)。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：建立银纳米团簇荧光响应体系后还包括加入辅酶Q10的步骤，所述辅酶Q10的终浓度为0.1-1.5％(w/v)。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述红细胞叶酸检测产品的使用方法包括以下步骤：
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述待测样本为全血样本时，还包括对样本进行预处理的步骤，所述预处理为将全血样本与抗坏血酸溶液混合，得到溶血溶液。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述抗坏血酸溶液的终浓度为1-2％(w/v)。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述全血样本与抗坏血酸溶液的体积比为1:(10-30)。
...【技术特征摘要】
1.一种基于银纳米团簇荧光响应体系的叶酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s1中，建立银纳米团簇荧光响应体系后还包括加入辅酶q10的步骤。
3.根据权利要求2所述的叶酸检测方法，其特征在于：所述辅酶q10的终浓度为0.1-1.5％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s1中，缓冲液的ph值为6.0-7.0。
5.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s1中，叶酸结合蛋白终浓度为0.05-0.2mm，银离子终浓度为0.3-0.5mm，柠檬酸钠终浓度为1-1.3mm，聚蔗糖400的终浓度为5-15％(w/v)。
6.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s1中，温度为0-10℃。
7.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s3中，待测样本与银纳米团簇荧光响应体系的体积比为(0.5-2):1。
8.根据权利要求1所述的叶酸检测方法，其特征在于：步骤s3中，所述孵育的时间为30-60分钟。
...【专利技术属性】
技术研发人员：范俊，袁文博，姜治国，李昺之，周彬，周衍，杨润琳，郭明明，张艺，陈月，
申请(专利权)人：无锡市江原实业技贸有限公司，
类型：发明
国别省市：
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