【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及一种胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5及其在甲基化检测中的应用，属于生物。
技术介绍
1、dna胞嘧啶甲基化（5mc）是dna中最常见的碱基修饰方式，约占所有胞嘧啶的1%-8%，被称为“第五种碱基”。dna甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性，是预测基因表达水平的有效依据。在肿瘤初期通常会发生抑癌基因甲基化水平升高或者原癌基因甲基化水平降低的现象，因此，dna甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。目前，检测dna甲基化的金标准是重亚硫酸盐测序法，通过重亚硫酸盐处理可使99.0%以上的c转化成u，而5mc保持不变，这样可以区分甲基化胞嘧啶，但重亚硫酸盐处理会严重损伤dna，导致数据质量差。近年来，酶转化法甲基化检测技术因为具备dna损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为dna甲基化检测领域的重要关注点。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5，在野生型apobec酶基础上进行了5个氨基酸位点的突变，分别为g25w、h29r、k30q、p134t、l135d，其氨基酸序列如seqid no:1所示。
2、本专利技术还公开了前述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5的编码基因。
3、优选的，编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
4、本专利技术还公开了前述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5在胞嘧啶脱氨中的应用，其中所述的胞嘧啶为c(胞
5、本专利技术还公开了前述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5在甲基化检测中的应用。
6、本专利技术还公开了一种甲基化检测方法βfdm-seq，其步骤包括：
7、（1） 用甲基转移酶m.mpei n374k和羧基-s-腺苷-l-蛋氨酸(carboxy-s-adenosyl-l-methionine，cxsam）处理样本 ，使dna链中的c变成5cxmc（5-羧甲基胞嘧啶），具体反应过程如图6所示；
8、（2） 用前述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5对dna链进行脱氨基处理，使得dna链中的5mc变为t；
9、（3） ngs建库，测序，获得5mc的位点信息。
10、优选的，所述步骤（3）中的建库为采用耐尿嘧啶高保真扩增的建库试剂建库。
11、本专利技术还公开了一种试剂盒，包括前述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5。
12、优选的，试剂盒还包括甲基转移酶m.mpei n374k和羧基-s-腺苷-l-蛋氨酸，还可以包括相应的反应buffer。
13、甲基转移酶m.mpei n374k是甲基转移酶m.mpei变体,其相对野生型甲基转移酶m.mpei具有374位突变,374位的天冬酰胺突变为了赖氨酸（n374k），在本专利技术的一些实施例中，该酶的氨基酸序列如seq id no:6所示。
14、本专利技术提供了一种apobec突变体、其编码核苷酸序列及基于apobec突变体甲基化检测方法，称为βfdm-seq（β-gt free directed methylation sequencing）。βfdm-seq首先使用甲基转移酶突变体m.mpei n374k和羧基-s-腺苷-l-蛋氨酸(carboxy-s-adenosyl-l-methionine，cxsam）使正常的c变成5cxmc，再用apobec mut5使5mc变为t，5hmc和5cxmc不被脱氨基，转化后的dna片段通过ngs建库测序和生物信息学分析可发现5mc功能位点，具有巨大的临床应用价值。βfdm-seq起始模板量低至10 ng，具有单碱基分辨率，对dna损伤小，且转化率高，其阳性位点检出率99.0%以上，准确性高，模板损伤小，数据质量高，这赋予了βfdm-seq比重亚硫酸盐测序在肿瘤早筛领域更为巨大的优势和潜力。
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1. 一种胞嘧啶脱氨酶突变体APOBEC mut5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体APOBEC mut5的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体APOBEC mut5在胞嘧啶脱氨中的应用，其中所述的胞嘧啶为C或者5mC。
5. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体APOBEC mut5在非疾病诊断目的的甲基化检测中的应用。
6.一种非疾病诊断目的的甲基化检测方法，其特征在于，其步骤包括：
7.根据权利要求6所述的非疾病诊断目的的甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中的建库为采用耐尿嘧啶高保真扩增的建库试剂建库。
8. 一种试剂盒，包括权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体APOBEC mut5。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括甲基转移酶M.MpeI N374K和羧基-S-腺苷-L-蛋氨酸。>...
【技术特征摘要】
1. 一种胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
4. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec mut5在胞嘧啶脱氨中的应用，其中所述的胞嘧啶为c或者5mc。
5. 权利要求1所述的胞嘧啶脱氨酶突变体apobec...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯策，陈晶晶，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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