【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测，具体涉及可快速检测玉米内州萎蔫病菌的引物对及方法。
技术介绍
1、玉米内州萎蔫病（goss's bacterial wilt and leaf blight of corn），是由玉米内州萎蔫病菌（clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis，简称cmn）引起的一种严重危害玉米作物的病害。该病害最初于1969年在美国内布拉斯加州被发现，目前病害已在美国中西部各州发生，包括印第安纳州、明尼苏达州、德克萨斯州及加拿大安大略省、曼尼托巴省等地。cmn是一种细菌性病原体，属于棒状细菌属（clavibacter）。
2、该病害主要影响玉米，尤其是马齿形玉米品种。病害的症状包括叶片上出现水浸状斑点，随后发展成萎蔫和枯死。病害严重时，可导致玉米产量损失高达40%。由于是细菌性病害，目前还没有有效的化学防治方法，因此预防和早期检测非常重要。
3、鉴于该病害的严重危害，世界上超过100 多个国家或地区采取了相应的措施防止其传入。
4、目前，国内尚无该病害分布的报道，但随着玉米进口量的增加，cmn传入中国的风险也随之增加。研究表明，国内玉米种植区的大部分均为该病原细菌潜在的适生区域。因此，玉米内州萎蔫病在国内传播、定殖的潜在风险非常高。
5、为了预防和控制该病害的传入和扩散，研究人员已经开发了多种检测方法，包括分离培养、免疫学方法、常规pcr、实时荧光定量pcr、巢式pcr等。这些检测方法的建立，有助于提高对玉米内州萎蔫病菌的检测灵
6、此外，adriana larrea-sarmiento等在2021年发表的“multiplex recombinasepolymerase amplification (rpa) assay developed using uniquegenomic regionsand coupled with a lateral flow device for rapid on-site detection ofgenusclavibacter”中提到了一种新型的多重重组酶聚合酶扩增（multiplex recombinasepolymerase amplification, rpa）检测技术，该技术与侧流装置（lateral flow device,lfd）联用，能够实现对棒状细菌属（clavibacter），特别是cmn的快速、灵敏和特异性的现场检测。但是，其灵敏度仍有进一步改善空间。
技术实现思路
1、本专利技术首先提供一种引物对，其含有上游引物及下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如下所示：5'- gaagggttccgaaatcggctattgcagcggatcg -3'；所述下游引物的核苷酸序列如下所示：5'- tcaagtaatgcttcaccagcacagcgagag -3'。
2、进一步的，本专利技术还提供一种引物探针组合，其含有：如前所述的引物对，以及探针；所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：cggatgacgtgcatttcccgatatgggcgg[荧光基团-dt]a[thf][荧光淬灭基团-dt]caacctcctctcccatc。
3、进一步的，本专利技术还提供一种试剂，其含有如上所述的引物对或如上所述的引物探针组合。
4、进一步的，本专利技术还提供一种试剂盒，其含有如上所述的引物对、如上所述的引物探针组合、或如上所述的试剂。
5、进一步的，本专利技术还提供一种检测玉米内州萎蔫病菌（clavibactermichiganensis subsp. nebraskensis）的方法，其包括：使用如上所述的引物对、或如上所述的引物探针组合、或如上所述的试剂、或如上所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行扩增反应，优选为rpa反应，而后对反应产物进行分析。
6、进一步的，本专利技术还提供一种检测玉米内州萎蔫病（goss's bacterial wilt andleaf blight of corn）的方法，其包括：使用如上所述的引物对、或如上所述的引物探针组合、或如上所述的试剂、或如上所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行扩增反应，优选为rpa反应，而后对反应产物进行分析。
7、本专利技术的引物能在扩增反应中特异性识别不同来源的玉米内州萎蔫病菌，而对其他相关亚种及相关菌株均无交叉反应。而且，本专利技术引物的检测灵敏度高，在实时荧光rpa中确认的最低检测浓度为10 cfu/μl，模拟种子带菌和叶片针刺接种结果检测结果理想。与其他检测方法相比，本专利技术中的rpa检测方法检测时间短，易于操作，而且具有较高的灵敏性和特异性，适合玉米内州萎蔫病菌的现场快速检疫。
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1.一种引物对，其含有上游引物及下游引物，
2. 一种引物探针组合，其含有：
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其中，
4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其中，所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5.一种试剂，其含有权利要求1所述的引物对或权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合。
6.一种试剂盒，其含有权利要求1所述的引物对、权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合、或权利要求5所述的试剂。
7. 一种检测玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis）的方法，其包括：使用权利要求1所述的引物对、或权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合、或权利要求5所述的试剂、或权利要求6所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行RPA反应，而后对反应产物进行分析。
8.一种检测玉米内州萎蔫病的方法，其包括：使用权利要求1所述的引物对、或权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合、或权利要求5所述的试剂、或权利要求6所述的试剂盒，对待测样品的核酸进
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述待测样品源自玉米或可能混有玉米种子的其他农作物。
10. 根据权利要求7或8所述的方法，其中，在进行RPA反应时，所述核酸的浓度大于等于0.0005pg/μL；或者，所述待测样品中的菌含量大于等于10 CFU/μL。
...【技术特征摘要】
1.一种引物对，其含有上游引物及下游引物，
2. 一种引物探针组合，其含有：
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其中，
4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其中，所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5.一种试剂，其含有权利要求1所述的引物对或权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合。
6.一种试剂盒，其含有权利要求1所述的引物对、权利要求2~4中任一项所述的引物探针组合、或权利要求5所述的试剂。
7. 一种检测玉米内州萎蔫病菌（clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis）的方法，其包括：使用权利要求1所述的引物对、或权利要求2...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡璐璐，赵文军，田茜，孟青青，张瑞平，潘磊，马云龙，许沛冬，
申请(专利权)人：三亚中国检科院生物安全中心，
类型：发明
国别省市：
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